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當前位置：上海信裕生物科技有限公司>>PCR試劑盒>>PCR-染料法>> 50次馬立克氏病病毒探針法熒光定量PCR試劑盒
| 供貨周期 | 一周 | 規(guī)格 | 50T |
|---|---|---|---|
| 貨號 | XY-0473 | 應用領域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,環(huán)保,化工,生物產業(yè),農業(yè) |
| 主要用途 | 熒光定量PCR具有更高的擴增效率、更高的擴增靈敏度、更高的擴增特異性。 |
馬立克氏病病毒探針法熒光定量PCR試劑盒
Marek’s Disease Virus(MDV
產品及特點
馬 立 克 氏 病 (Marek's disease,MD) 是 由 雞 馬 立 克 氏 病 病 毒 (Marek's disease virus,MDV)引起的一種雞的淋巴組織增生性腫瘤病，其特征為外周神經 淋巴樣細胞浸潤和增大，引起肢（翅）麻痹，以及性腺、虹膜、各種臟器、肌肉 和皮膚腫瘤病灶。本病是一種世界性疾病，目前是危害養(yǎng)雞業(yè)健康發(fā)展的三大主 要疫病（馬立克氏病、雞新城疫及雞傳染性法氏囊?。┲?，引起雞群較高的發(fā) 病率和死亡率。因此快速靈敏檢測馬立克氏病病毒具有重要意義。本產品就是為 此目的根據(jù) PCR 原理開發(fā)的試劑盒，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2. 引物和探針經過優(yōu)化，靈敏性高。
3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4.特異性高，引物是根據(jù)馬立克氏病病毒高度保守區(qū)設計，不會跟其他病毒的 DNA 發(fā)生交叉反應。
5. 本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。
6. 本產品只能用于科研。
馬立克氏病病毒探針法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分
編號 | 成分 | 規(guī)格 |
試劑一 | 2×Probe qRT-PCR MagicMix | 500 μL（本色蓋） |
試劑二 | 熒光 PCR 模板稀釋液 | 1 mL（黃蓋） |
試劑三 | 馬立克氏病病毒探針法 qPCR 引物混合液 | 100 μL（白蓋） |
試劑四 | 馬立克氏病病毒qPCR探針 | 50 μL（棕色管） |
| 試劑五 | 馬立克氏病病毒陽性對照 (1×10E8 拷 貝/μL) | 50 μL (黃蓋） |
| 試劑六 | 天凈沙核酸釋釋劑（試用裝） | 20 次（1mL，綠蓋） |
試劑七 | 使用手冊 | 1 份 |
運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。
自備試劑 樣品 DNA。
使用方法 一、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。 由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原， 本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對照。
1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 模板稀釋液，用帶芯槍 頭，下同）。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震 蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 RNA 的制備
7. 如果有 N 個樣品，設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性 對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容。
三、Probe qRT-PCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個 用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用 水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模 板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設 置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好 后后加）：
成分 | 樣品管 N+2個 | PCR陰性對照管 | 標準曲線 樣品管（2-7管） |
2×Probe qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 各10 μL |
馬立克氏病病毒 qPCR 探針 | 1 μL | 1 μL | 各2 μL |
馬立克氏病病毒探針法 qPCR 引物混合液 | 2 μL | 2 μL | 各2 μL |
待測樣品DNA模板 | 7 μL | 不加 | 不加 |
| 超純水 | 7 μL | ||
第7步所得標準曲線樣品稀釋液（2-7號） | 不加 | 不加 | 各7 μL（2號樣到2號管，3號樣到3號管…） |
11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 PCR：
過程 | 溫度 | 時間 |
預變性 | 95℃ | 5 min |
PCR反應 （40個循環(huán)） | 95℃ | 15sec |
60℃ | 60sec（采集FAM通道的熒光信號） |
四、數(shù)據(jù)處理
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大 于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該 小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小 于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。
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