PUREfrex® 是一款單獨純化蛋白合成所需的因子后，與氨基酸和NTP等混合重組的蛋白合成試劑盒。通過減少試劑盒中的大腸桿菌來源脂多糖，合成的蛋白無需純化即可直接用于細胞實驗和檢測。對于初次想要嘗試本產(chǎn)品的用戶，本產(chǎn)品還可提供小包裝規(guī)格。

PUREfrex^® 酶無細胞蛋白合成試劑盒

PUREfrex^® 是一款單獨純化蛋白合成所需的因子后，與氨基酸和NTP等混合重組的蛋白合成試劑盒。通過減少試劑盒中的大腸桿菌來源脂多糖，合成的蛋白無需純化即可直接用于細胞實驗和檢測。對于初次想要嘗試本產(chǎn)品的用戶，本產(chǎn)品還可提供小包裝規(guī)格。

從減少塑料使用的環(huán)保觀點出發(fā)，并為了滿足需要更多反應液的客戶需求，PUREfrex^® 試劑盒系列已停止生產(chǎn)5×250 µL反應用（1.25 mL反應用）規(guī)格的產(chǎn)品，并全新推出了“2 mL反應用"規(guī)格的產(chǎn)品。

新規(guī)格與舊規(guī)格產(chǎn)品相比，反應液的性價比更高。

◆關于PUREfrex^®

PUREfrex^® 是基于PURE system開發(fā)的重組無細胞蛋白合成試劑盒。PURE system是東京大學的上田卓業(yè)教授團隊開發(fā)的重組無細胞蛋白合成系統(tǒng)，是將轉(zhuǎn)錄、翻譯和能量回收所需的蛋白和核糖體單獨純化，然后與氨基酸、NTP等混合的合成系統(tǒng)。通過添加編碼目標蛋白的DNA或mRNA至反應液中進行反應來合成蛋白。由于使用了組分經(jīng)純化的混合反應液，因此具有可自由調(diào)整其組成，且?guī)缀醪缓c翻譯等無關的蛋白的優(yōu)點。

PUREfrex^® 改良了反應液中蛋白、核糖體和tRNA的制備方法，是一款與傳統(tǒng)產(chǎn)品相比，純度更高的合成反應溶液。此外，大腸桿菌來源的污染性脂多糖含量降低至每µL反應液10^-1 EU以下，并且 RNase和β-半乳糖苷酶等污染蛋白也有減少。此外，PUREfrex^® 的所有蛋白（包括翻譯因子等）中均不含純化和檢測用的標簽。因此可合成添加了任何標簽序列的蛋白，后續(xù)可利用該標簽進行純化和檢測。

使用PURE系統(tǒng)進行蛋白合成的原理圖

◆特點

● 由經(jīng)純化組分組成的反應液，非細胞提取液。

● 可以利用多種模板進行反應，還能合成Fab等多聚體。（多種模板混合下的Fab合成示例見下文）

● 可合成活細胞難以合成的強毒性蛋白。（蛋白毒性合成示例見下文）

● 模板DNA可直接添加至PCR反應液使用。

● 反應液量內(nèi)合成的蛋白量幾乎恒定（數(shù) µL～數(shù) 10 mL）。

● 操作簡便，僅需在單試管中37℃孵育數(shù)小時。

● 可合成帶標簽的蛋白，用于下游純化和檢測。

◆使用PUREfrex^® 進行蛋白合成的實驗流程

◆PUREfrex^® 使用方法

通過下方鏈接查看視頻：

http://labchem.fujifilm-wako.com.cn/product/show/1610.html

實驗方案示例

使用PUREfrex^®1.0 時，可使用任意體積的反應液進行蛋白合成。例如，20 μL時反應液的制備方法如下所示。

1.  將SolutionⅠ在室溫~37℃下加熱1 min左右至充分融解，隨后置于冰上。

2.  將Solution Ⅱ和Solution Ⅲ置于冰上融解。

3.  將融解的SolutionⅠ，Ⅱ，Ⅲ輕輕渦旋后，離心并收集試管底部的內(nèi)容物。

4.  根據(jù)下述列表制備反應液。（DNA添加量為每kbp 0.5-3 ng/ μL）

5. 在37°C的加熱塊或水浴中反應 2~4 h，合成蛋白。^注2

6. 合成的蛋白可用于多種用途。^注3

注意事項

注1）模板DNA請根據(jù)目標蛋白自行制備。

注2）如果在氣相恒溫器（如培養(yǎng)恒溫器）中進行反應，反應溶液的溫度上升需要花費更多的時間，合成量會有所降低。

注3）通過SDS-PAGE確認合成時，請用水稀釋反應液后進行電泳。

       詳情請通過鏈接查看：https://www.genefrontier.com/en/downloads/purefrex/?noredirect=en_US

注4）反復凍融會導致活性降低，因此，實驗系統(tǒng)用量較少時，建議少量分裝。少量分裝后，請將Solution Ⅱ和Solution Ⅲ用液氮或干冰/乙醇快速冷凍，并在-20°C 或 -80°C 下儲存。若不快速冷凍，而是直接放入注4-80℃緩慢冷凍，會導致核糖體（Solution Ⅲ）等因子失去活性。此外，為避免核酸酶污染，建議佩戴手套和口罩。

◆模板DNA設計

蛋白合成時，向本試劑盒Solution Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ 的混合反應液中添加模板DNA，同時進行轉(zhuǎn)錄和翻譯反應。注意，制備適合PUREfrex^® 合成的模板DNA是蛋白合成的關鍵之一。詳細的制備方法請參閱模板DNA網(wǎng)頁：

https://www.genefrontier.com/en/faq/purefrex-template-dna/?noredirect=en_US

使用PUREfrex^® 設計適合蛋白合成的模板DNA時的要點

● 對于ORF整體：

基于大腸桿菌密碼子的使用頻率使用密碼子

將導致移碼的序列（如 X/XXY/YYYZ）替換為其他的密碼子

● 對于N端：

使用富含AT堿基的密碼子

開始使用蛋氨酸后，應立即盡可能避免使用脯-氨酸和甘-氨酸。

● 對于5’UTR區(qū)：

含SD序列（核糖體結合序列）

SD 序列上游含15 個或以上的富含AT堿基的序列

PUREfrex^® 2.0mini —適合初次使用的用戶

進行蛋白表達時，需要考慮宿主、表達載體、誘導、不溶性等多種因素，初次使用PUREfrex^® 或初次嘗試無細胞系統(tǒng)的用戶可能會產(chǎn)生是否真的可以合成蛋白，或者即使成功合成，蛋白合成量是否太少的疑問。

對于PUREfrex^® _，因為任何生物來源蛋白的模板DNA組成均相同，所以無需考慮宿主或載體等因素。PUREfrex^® 2.0mini 附帶通用引物和詳細說明，因此，適合初次使用的用戶嘗試合成所需的蛋白。

◆蛋白合成反應液和添加劑的選擇

請根據(jù)用途選擇蛋白合成反應液和添加劑。

蛋白合成反應液

● PUREfrex^® 1.0

PUREfrex^® 1.0 已公開反應液組成，適用于產(chǎn)品定制等需要組成成分信息的研究。此外，雖然使用 PUREfrex^® 2.0 合成蛋白時的速度較快，但可能無法及時形成和折疊二硫鍵等導致不溶時，此時使用合成速度較慢的PUREfrex^® 1.0 效果可能更好。

反應液組成請通過鏈接查看：

https://www.cosmobio.co.jp/product/uploads/document/GFK_PUREfrex_1.0_contents_Oct2016.pdf

● PUREfrex^® 2.0

PUREfrex^® 2.0 改良了PUREfrex^® 1.0 的反應液組成，提高了蛋白合成效率，從而增加了反應液內(nèi)的蛋白合成量。適用于需要合成大量蛋白及多種蛋白的研究。反應液組成保密。

● 合成量對比數(shù)據(jù)（見下文）

● 添加劑效果對比（見下文）

● PUREfrex^® 2.1

PUREfrex^® 2.1 適用于需嚴格控制氧化還原狀態(tài)的含二硫鍵結合的蛋白合成。它在保留PUREfrex^® 2.0 反應液組成的基礎上，單獨添加了還原劑，因此可根據(jù)添加的還原劑（和氧化劑）種類和數(shù)量來調(diào)整合成過程中的氧化還原狀態(tài)。并且，還可用于探討適用于細胞中難以表達的含二硫鍵結合的蛋白合成條件。此外，作為添加劑的DsbC Set（原：DS supplement）和DnaK Mix也能加入反應液中使用。

● AppA合成示例和IgG合成示例（見下文）

蛋白合成用添加劑

● DnaK Mix

DnaK Mix是經(jīng)高度純化的大腸桿菌來源的DnaK、DnaJ、GrpE蛋白以適當?shù)臐舛缺壤A混后的溶液。

●GroE Mix

GroE Mix是經(jīng)高度純化的大腸桿菌來源的GroEL、GroES蛋白以適當?shù)臐舛缺壤A混后的溶液。

此類分子伴侶混合物可有助活性蛋白的合成，而僅使用單個分子伴侶往往難以形成高階結構。

目前還未明確哪種添加劑效果好，實際效果取決于需合成的蛋白。但如果是初次嘗試，推薦使用合成效果更廣泛的DnaK Mix。

● DsbC Set （原：DS supplement)

含有作為氧化谷胱-甘肽（GSSG）和二硫鍵異構酶的大腸桿菌 DsbC。

● PDI Set

含有氧化谷胱-甘肽（GSSG）、人源二硫鍵異構酶（PDI）和PDI的氧化酶Ero1α。

可為形成二硫鍵創(chuàng)造優(yōu)質(zhì)環(huán)境。二硫鍵的形成可能只需要氧化劑GSSG，也可能需要具有二硫鍵異構化活性的DsbC或PDI。氧化劑GSSG和Ero1α一樣也會氧化PDI，但它還可以氧化反應液整體。另一方面，Ero1α 是一種特異性氧化PDI的酶，如果無需氧化整個反應溶液時，建議使用Ero1α（PDI 組）。

● EF-P

大腸桿菌的翻譯因子之一，在合成含有連續(xù)脯-氨酸殘基的蛋白時添加，可以增加合成量。

◆產(chǎn)品數(shù)據(jù)

PUREfrex^®1.0 和2.0 的合成量對比

合成原核生物和真核生物來源蛋白的結果顯示，與PUREfrex^®1.0 相比，使用PUREfrex^® 2.0 合成時各種蛋白的合成量增加。

添加劑效果對比

使用單試管合成多個不同的模板DNA

在多模板混合條件下添加 DsbC Set（原 DS supplement）合成 Fab 的示例

在PUREfrex^® 2.0 的基礎上添加DS supplement合成的結果顯示，成功合成了由輕鏈（LC）和重鏈（HC）通過分子間二硫鍵相連而成de 活性Fab，且該活性Fab可以和抗原結合。另外，通過優(yōu)化輕鏈（LC）和重鏈（HC）的模板DNA的添加比例，結果顯示活性Fab的產(chǎn)量增加。（最高產(chǎn)量為0.5 mg/mL）

合成強毒性蛋白

蛋白毒素（Gelonin）的合成示例

a）使用PUREfrex^®2.0 合成Gelonium multiflorum植物種子來源的蛋白毒素的實驗中，結果顯示成功合成了具有蛋白翻譯抑制活性的毒素。

b）在HeLa 細胞來源的無細胞表達系統(tǒng)中合成 GFP時， 通過比較添加合成了Gelonin蛋白的PUREfrex^® 反應液（未純化）時的GFP活性，來確認翻譯抑制的活性。(最高產(chǎn)量為0.5 mg/mL）

* Gelonin的分子量為30 kDa，通過滅活真核細胞的核糖體來抑制翻譯。

起始密碼子后的氨基酸密碼子對合成量的影響

曲-妥珠單抗重鏈（VH+CH1）的合成示例（替換起始密碼子后的密碼子）

使用PUREfrex^®2.0，通過用了起始密碼子后的第2~6個氨基酸處不同密碼子的56種模板 DNA 合成Trastuzumab 的重鏈（VH+CH1）。結果顯示，最高合成量和最少合成量間相差約50倍。合成量最高的模板 DNA 是使用低GC含量密碼子的模板 DNA（AT），合成量隨著 GC含量的增加而減少。此外，與大腸桿菌中使用頻率高的密碼子相比，通過使用了頻率低但GC含量少的密碼子的模板 DNA 進行合成時，合成率更高。

通過 PUREfrex^® 2.1 合成含二硫鍵結構的蛋白

1. 酸性磷酸酶（AppA）活性測試

使用DTT和GSH（還原型谷-胱甘肽）兩種還原劑與改變濃度的GSSG（氧化型谷-胱甘肽）和大腸桿菌的二硫化物異構酶DsbC合成需要二硫鍵（SS鍵）的 AppA^*1，并比較其合成量和活性，結果顯示，雖然從還原凝膠的電泳分析中沒有發(fā)現(xiàn)合成量的顯著差異，但活性根據(jù)使用的還原劑類型和濃度各異。

（*1 AppA有5個二硫鍵，其中一個為不連續(xù)的半胱-氨酸殘基間的二硫鍵。）

2. IgG的合成

通過添加 GSSG（氧化型谷-胱甘肽）、大腸桿菌的二硫鍵異構酶 DsbC 和分子伴侶，并使用不同種類的還原劑，合成通過二硫鍵（SS 鍵）形成的兩條L鏈（輕鏈）和兩條H鏈（重鏈）的四聚體結構IgG。比較其合成量和活性的結果顯示，雖然從還原凝膠的電泳分析中沒有發(fā)現(xiàn)合成量的顯著差異，但活性根據(jù)使用得還原劑類型和濃度各異。

更多其他的無細胞蛋白合成示例的數(shù)據(jù)詳情請通過鏈接查看：

https://www.genefrontie.com/en/cases/purefrex/?noredirect=en_US

大量論文引用，詳情請通過鏈接查看：

https://www.genefrontier.com/en/publications/purefrex/?noredirect=en_US

查看相關產(chǎn)品詳情：PUREfrex^® 1.0：http://labchem.fujifilm-wako.com.cn/product/show/1609.html

查看相關產(chǎn)品詳情：PUREfrex^® 2.0：http://labchem.fujifilm-wako.com.cn/product/show/933.html

查看相關產(chǎn)品詳情：PUREfrex^® 2.1：http://labchem.fujifilm-wako.com.cn/product/show/1611.html


◆產(chǎn)品列表

蛋白合成反應液PUREfrex^® 1.0

蛋白反應溶液PUREfrex^® 2.0

蛋白反應溶液PUREfrex^® 2.1

蛋白合成用添加劑DnaK Mix / GroE Mix

形成高階結構，提高溶解度（分子伴侶）

蛋白合成用添加劑DsbC Set (原：DS supplement)

促進二硫鍵形成

蛋白合成用添加劑PDI Set

促進二硫鍵形成

蛋白合成用添加劑EF-P

用于含有連續(xù)脯-氨酸的蛋白合成

◆關于蛋白合成

Q1:是否可以合成人源蛋白等大腸桿菌以外的蛋白？

PUREfrex^® 是大腸桿菌來源的重組翻譯系統(tǒng)的蛋白合成系統(tǒng)，但也能合成哺乳動物和植物等高等真核生物來源的蛋白。查看合成各種蛋白的實例：https://www.genefrontier.com/en/

然而， 根據(jù)GC含量和次要密碼子的出現(xiàn)頻率等核酸序列，可能會降低蛋白合成的效率。

比起蛋白來源，模板DNA的堿基序列或氨基酸序列可能會影響蛋白的合成量，通過優(yōu)化因果序列可以改善蛋白合成量。

Q2: 使用PUREfrex^® 的蛋白合成量是多少？

這個取決于合成的蛋白。例如，試劑盒附帶的對照模板DNA二氫葉-酸還原酶 (DHFR)使用PUREfrex^® 1.0 和PUREfrex^® 2.0 時，每毫升反應液分別可合成約 150 µg和 600 µg。

Q3：是否可以合成和純化標簽蛋白？

PUREfrex^® 中的所有蛋白均不含純化和檢測用的標簽。因此，可以使用所有標簽序列，如組-氨酸標簽（His tag）。

His tag標簽蛋白的純化方法請查看：https://www.genefrontier.com/cases/purefrex/applications-09/

Q4：是否可以同時合成多種蛋白？

使用不同蛋白編碼的多個模板DNA，可在單試管中同時合成多種蛋白。

實驗結果顯示，根據(jù)模板DNA合成的蛋白量有差異時，可以通過調(diào)整模板 DNA 的添加量比例來調(diào)整蛋白合成量。

IgG 的輕鏈 (LC) 和重鏈 (HC)同時合成的結果請查看：https://www.nature.com/articles/s41598-018-36691-8

Q5：PUREfrex^® 可合成的蛋白分子量是多少？

多個殘基的肽可以合成分子量約為 100 kDa 的蛋白；β-半乳糖苷酶的合成示例請查看：

https://www.genefrontier.com/cases/purefrex/applications-05/

Q6：PUREfrex^® 是否含有分子伴侶？

PUREfrex^® 是一種僅包含轉(zhuǎn)錄和翻譯所需因子的蛋白合成系統(tǒng)，因此不含分子伴侶。Gene Frontier推出了一系列可添加至 PUREfrex^® 中使用的分子伴侶，如 Hsp70（DnaK Mix：#PF003-0.5）和 Hsp60（GroE Mix：#PF004-0.5）。

Q7：是否能夠合成具有二硫鍵的蛋白（如抗體）？

可以合成。當?shù)鞍仔枰蜴I才具有活性時，請向 PUREfrex^® 中加入添加劑 DsbC Set (#PF005-0.5) 或 PDI Set (#PF006-0.5)使用。建議使用已優(yōu)化合成條件的 PUREfrex^® 2.1 (#PF213-0.25) 。

抗體 (IgG, Fab, scFv)的合成示例請查看：https://www.nature.com/articles/s41598-018-36691-8

Q8：是否可以合成膜蛋白？

可以合成。但是，大部分情況下合成的膜蛋白會形成聚集。通過將脂質(zhì)體和納米盤等脂質(zhì)成分添加至PUREfrex^® 反應液合成膜蛋白，或可合成含脂質(zhì)成分的膜蛋白。

查看使用納米盤的合成示例：https://www.genefrontier.com/cases/purefrex/applications-11/

Q9：是否可進行糖基化和N端修飾等翻譯后修飾？

PUREfrex^® 是一種僅重組轉(zhuǎn)錄和翻譯所需因子的蛋白合成系統(tǒng)，因此，無法單獨進行糖基化和N端修飾等翻譯后修飾。但是，可以通過向反應液添加翻譯后修飾酶及其底物來進行翻譯后修飾。

關于糖基化的信息，請查看鏈接：https://www.genefrontier.com/cases/purefrex/applications-19/

關于N端乙酰化和肉豆蔻?；男畔?，請查看鏈接：https://www.genefrontier.com/cases/purefrex/applications-20/

Q10：是否可合成[35S] 蛋氨酸或 [3H] 亮-氨酸等放射性同位素標記的蛋白？

通過添加含有[35S] 蛋氨酸或 [3H] 亮-氨酸等放射性同位素的氨基酸至合成反應液進行合成，可以合成放射性同位素標記的蛋白。另外，PUREfrex^® 1.0 含有20種天然氨基酸，其最終濃度均已調(diào)至0.5 mM。

Q11：分泌蛋白的合成需要信號序列嗎？

使用 PUREfrex^® 合成時，不需要信號肽，但翻譯是從不會變成N端的序列開始的，這可能會導致合成量降低。因此，建議優(yōu)化除信號序列以外的序列（尤其是N端）。詳情可查看模板DNA問題1。

Q12：PUREfrex^® 的密碼子出現(xiàn)頻率與大腸桿菌相同嗎？

PUREfrex^® 使用從大腸桿菌中制備的tRNA混合物，各tRNA的濃度均反映了大腸桿菌中tRNA濃度。因此，大腸桿菌內(nèi)含量較低的tRNA在PUREfrex^® 反應液中的含量也較低。

綜上，PUREfrex^® 合成蛋白的模板DNA建議使用與大腸桿菌使用頻率相匹配的密碼子。

此外，設計模板DNA時的注意事項請查看：https://www.genefrontier.com/solutions/purefrex/technology/template-dna/page-01/

Q13：PUREfrex^® 中表達的蛋白/肽的N端蛋氨酸是否甲酰化？如果是甲?；?，翻譯過程中和翻譯后是否會脫甲?；?/span>

使用 PUREfrex^® 合成的蛋白的N端蛋氨酸被甲?；?，并且在翻譯過程中和翻譯后也不會去甲酰化。

但是，根據(jù)合成的蛋白量的不同，甲?；w耗盡，合成的蛋白中可能會混有部分沒有甲?；牡鞍?。即使N端蛋氨酸未被甲?；?，PUREfrex^® 也能繼續(xù)進行翻譯反應，但根據(jù)合成的蛋白不同，可能會影響合成效率。

◆關于模板DNA

Q1：模板DNA的制備和優(yōu)化的要點是什么？

關于模板DNA的制備和優(yōu)化的要點請查看以下頁面。

關于模板DNA：https://www.genefrontier.com/solutions/purefrex/technology/template-dna/page-01/

模板DNA序列相關的6點注意事項：https://www.genefrontier.com/solutions/purefrex/technology/template-dna/page-01/

Q2：靶蛋白基因的上游需要什么序列？

模板DNA在編碼靶蛋白的基因上游至少需要T7啟動子序列和核糖體結合位點（SD 序列）。

Q3:可以使用T7啟動子以外的啟動子嗎？

PUREfrex^® 的反應液中含有作為轉(zhuǎn)錄酶的T7 RNA聚合酶，所以推薦使用含T7啟動子的模板DNA。使用其他啟動子時，需添加該啟動子對應的RNA聚合酶進行反應。

Q4: 5’UTR的序列可以改變嗎?

可以改變。但是，5’UTR序列會影響蛋白合成量，5’UTR序列對合成回收量的影響請查看下方鏈接：

https://www.genefrontier.com/files/p29_MBSJ2021.pdf

目前，GeneFrontier設計的5' UTR 序列的蛋白合成量較高。序列中各區(qū)域?qū)铣闪康挠绊懜鳟?，因此，請根?jù)實驗目的進行調(diào)整。

Q5：可以使用哪些終止密碼子？

PUREfrex^® 中所含的兩種翻譯終止因子（解離因子），與三種終止密碼子（UAG(amber)、UGA(opal)、及UAA(ochre)）相兼容，因此可以使用任意一種終止密碼子。

Q6：靶蛋白基因的下游需要什么序列？

使用環(huán)狀DNA時，編碼靶蛋白的基因下游需要終止轉(zhuǎn)錄的T7 終止序列。使用直鏈DNA時，請在終止密碼子的下游添加10個以上的堿基。此外，對于直鏈DNA，終止密碼子下游不一定需要T7終止序列。

Q7：當使用兩步PCR制備PUREfrex^® 用的模板DNA時，對于"REV primer"是否存在“10個堿基以上的任意序列"的限制要求呢？

“REV primer"基本上是可任意選擇的，但是需要注意以下幾點。

● ORF部分的C端之后的"taatga "部分是2個終止密碼子并列的序列。

● 比起序列，長度更重要。長度小于10個堿基會影響合成效率；長度大于10個堿基，即使是20個堿基也沒問題。

● 應盡可能避免在終止密碼子后放入可形成剛性二級結構的序列（如高GC含量）。

● 例如，該部分可插入限制性酶切位點。

Q8：反應溶液中應該加入多少模板DNA？

無論是質(zhì)粒還是 PCR 產(chǎn)物，DNA的添加量均為每 kbp 0.5-3 ng/µL。

添加至PUREfrex^® 反應液中的DNA以分子數(shù)（摩爾濃度）為基準，添加后的最終濃度應在2 nM 左右。例如，添加至反應液中的DNA是長度為6 kbp的質(zhì)粒（環(huán)狀DNA）時，則無論實際 ORF 長度如何，添加量應均為(0.5~3)×6 = 3~18 ng/µL。

Q9：模板DNA能否溶解于TE緩沖液中使用？

TE 緩沖液中所含的EDTA可能會抑制轉(zhuǎn)錄和翻譯反應，減少蛋白合成量。溶解DNA時，建議使用不含EDTA的緩沖液或Milli-Q水。

Q10：直接添加PCR反應液時應注意什么？

為了減少從PCR反應液中引入鹽等物質(zhì)，添加量請不要超過PUREfrex^® 反應液量的 1/10。PCR 反應液中引入的污染會改變鹽濃度降低轉(zhuǎn)錄和翻譯反應的活性。

PCR產(chǎn)物濃度較低時，應避免增加未純化PCR反應液的添加量，可考慮使用DNA純化試劑盒等制備足夠濃度的DNA溶液。

【參考】使用PCR產(chǎn)物作為模板DNA使用時：https://www.genefrontier.com/solutions/purefrex/technology/template-dna/page-02/

Q11:PCR產(chǎn)物所需的純度是多少？

如果在PCR后的電泳中發(fā)現(xiàn)目標產(chǎn)物以外的條帶時，請?zhí)接慞CR條件以抑制副產(chǎn)物的產(chǎn)生。由于副產(chǎn)物也可能會合成蛋白，所以通過PCR獲得的條帶純度會影響蛋白的合成效率。當改變PCR條件仍產(chǎn)生副產(chǎn)物時，需將目標條帶從凝膠中切下并純化。從凝膠切下條帶時，為避免DNA損傷（可能會影響轉(zhuǎn)錄反應），請不要使用紫外線照射。可以使用藍光，但應盡量縮減照射時間。

【參考】使用PCR產(chǎn)物作為模板DNA使用時：https://www.genefrontier.com/solutions/purefrex/technology/template-dna/page-02/

Q12：是否能使用人工合成的DNA作為模板？

含啟動子序列的人工合成片段可以作為模板DNA使用。此外，也可以從僅合成ORF的DNA中，使用含有啟動子序列等所需序列的引物，通過PCR來制備模板DNA。但是，根據(jù)基因合成生產(chǎn)商的不同，可能會在交付的產(chǎn)品中添加抑制蛋白合成反應RNase。當無法合成目標蛋白時，可嘗試添加RNase抑制劑或嘗試使RNase滅活。

此外，對于以質(zhì)粒形式作為模板DNA，請查看使用質(zhì)粒作為模板DNA使用時的注意事項：https://www.genefrontier.com/solutions/purefrex/technology/template-dna/page-03/

Q13：哪些質(zhì)粒載體可用作模板DNA？

可使用含有T7 promoter、SD 序列和 T7 terminator的載體。例如，pET型（Merck公司）、pQE型（Qiagen 公司）等。但是，存在lac operator序列時，可能會減少蛋白合成量，因此推薦使用不含lac operator序列的載體，如pET17等。

Q14：制備模板質(zhì)粒時應該注意什么？

制備質(zhì)粒DNA 時，注意不要讓純化時添加至使用緩沖液的RNase活性殘留在最終純化物中。

例如，在使用膜型純化試劑盒（如 Qiagen的QIAprep Spin Miniprep Kit或Promega 的Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System）時，Lysis buffer中所含的RNase A會混入最終純化的DNA溶液中。如果直接作為模板DNA添加至PUREfrex^® 反應溶液中，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物等的RNA會被分解，抑制蛋白合成。

當使用這種純化試劑盒純化的DNA溶液，可通過Phenol/Chloroform處理使RNase滅活，再通過乙醇沉淀等再次純化，即可制備不含RNase活性的DNA溶液。或者，可在 PUREfrex^® 反應液中添加RNase inhibitor來合成蛋白。另一方面， Qiagen的 Plasmid Mini Kit 在洗脫與樹脂結合的DNA后，向洗脫液添加isopropanol使DNA沉淀，可抑制RNase 活性污染。已確認通過該試劑盒純化的質(zhì)?？芍苯邮褂?。

【參考】使用質(zhì)粒作為模板DNA的注意事項：https://www.genefrontier.com/solutions/purefrex/technology/template-dna/page-03/

Q15：如何使用RNA作為模板？

使用mRNA合成蛋白時，請使用起始密碼子上游中包含SD序列的mRNA。另外，mRNA的添加濃度大約為0.1～1 µM。由于適用濃度因所用mRNA的序列和純度而異，建議參考上述濃度范圍，探討添加濃度的決定條件。