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技術(shù)課堂 | 部署原位拉曼光譜實(shí)現(xiàn)生物過程的可視化
“生物過程是發(fā)現(xiàn)和制備藥物、特殊化學(xué)品、大宗能源及化學(xué)品的重要手段。先進(jìn)的檢測及控制技術(shù)的缺乏極大限制了發(fā)酵過程的產(chǎn)率及產(chǎn)能，也對(duì)于發(fā)酵產(chǎn)物的質(zhì)量有重要影響。原位拉曼光譜技術(shù)是一種可靠的PAT方法，可實(shí)現(xiàn)對(duì)于發(fā)酵過程中營養(yǎng)物、代謝物和產(chǎn)物以及細(xì)胞生長參數(shù)等指標(biāo)的在線檢測。在線過程分析技術(shù)帶來的豐富數(shù)據(jù)可以進(jìn)一步提升發(fā)酵過程工藝水平，并最終實(shí)現(xiàn)QbD（質(zhì)量源于設(shè)計(jì)）。”
細(xì)胞培養(yǎng)是培養(yǎng)細(xì)胞獲取重組蛋白、抗體等生物大分子生產(chǎn)中的過程，這一過程直接影響到產(chǎn)品的產(chǎn)量及質(zhì)量。由于細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境及培養(yǎng)策略會(huì)直接影響細(xì)胞的生長狀況，為保證細(xì)胞正常生長、提高產(chǎn)量及保證產(chǎn)品質(zhì)量，必須監(jiān)控細(xì)胞培養(yǎng)過程。
目前，一般只對(duì)發(fā)酵過程的工藝參數(shù)，如pH、溫度、溶氧(DO)、攪拌速度等進(jìn)行在線檢測和控制，而與產(chǎn)品質(zhì)量密切相關(guān)的生化指標(biāo)仍采用取樣分析方式。傳統(tǒng)的離線取樣存在取樣時(shí)間間隔較長、分析繁瑣等問題，難以滿足細(xì)胞生長的實(shí)時(shí)監(jiān)測與分析要求，因此亟需開發(fā)發(fā)酵過程中生化指標(biāo)的離線快速檢測或在線檢測方法。
圖1 發(fā)酵過程及關(guān)鍵工藝參數(shù)和相關(guān)技術(shù)指標(biāo)的檢測
PAT技術(shù)加速生物過程工藝開發(fā)和優(yōu)化
過程分析技術(shù)（PAT）是美國食品和藥物管理局（FDA）與歐洲藥品管理局（EMA）倡導(dǎo)的制藥行業(yè)工藝研究與生產(chǎn)的技術(shù)。PAT的本質(zhì)是通過實(shí)時(shí)測量原料、過程中物料以及過程本身的關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)來實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)過程的設(shè)計(jì)、分析和控制。實(shí)施PAT能夠簡化分析過程，為生物制造過程提供連續(xù)的工作流程，并為提前發(fā)現(xiàn)和解決問題創(chuàng)造可能性。
在線光譜技術(shù)是一種現(xiàn)實(shí)可行的PAT策略，可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)過程展示，在線參數(shù)監(jiān)測以及過程反饋控制。常見的在線光譜分析方法包括在線近紅外 (near-infrared，NIR)、在線中紅外(mid-infrared，MIR)、在線拉曼（Raman）光譜等。
圖2 梅特勒托利多在線光譜儀： ReactIR™ FTIR（傅里葉變換）光譜儀和ReactRaman™原位拉曼光譜儀
水是細(xì)胞培養(yǎng)液的主要成分，在近紅外光譜和中紅外光譜中吸收較強(qiáng)，培養(yǎng)液中其他成分的紅外光譜信息很容易被水的吸收峰掩蓋。而水的拉曼信號(hào)較弱，相比于紅外光譜，拉曼光譜更適合于水體系的分析，其能提供更高特異性的分子指紋信息。因此，拉曼光譜更適合用于生物過程的分析和應(yīng)用。
拉曼光譜技術(shù)可原位同步分析發(fā)酵過程中營養(yǎng)物、代謝物和產(chǎn)物的組分濃度變化，借助化學(xué)計(jì)量學(xué)數(shù)學(xué)模型，甚至可實(shí)現(xiàn)同步監(jiān)測活細(xì)胞密度（VCD）、總細(xì)胞密度（TCD）、細(xì)胞活率（VIB）等生化指標(biāo)，實(shí)現(xiàn)生物過程的實(shí)時(shí)在線過程監(jiān)測。
圖3 拉曼光譜技術(shù)可實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過程的原位在線監(jiān)控
ReactRaman™ 原位拉曼光譜儀可以在幾秒鐘內(nèi)收集和分析光譜，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物過程的密切監(jiān)控。在定量模型的基礎(chǔ)上，研究人員可以對(duì)多參數(shù)進(jìn)行快速和同時(shí)檢測；甚至在整合入生物反應(yīng)器后，完成某一關(guān)鍵參數(shù)或物料流加的反饋控制循環(huán)。
基于所關(guān)注參數(shù)的定量模型，只需根據(jù)時(shí)刻點(diǎn)的光譜數(shù)據(jù)即可獲取該時(shí)刻下對(duì)應(yīng)的所關(guān)注指標(biāo)的數(shù)值。相比于傳統(tǒng)的離線分析方法，拉曼光譜法可以大大縮短分析時(shí)間，這對(duì)于研發(fā)人員和分析儀器資源的優(yōu)化具有重要意義。很少的取樣量（低至1ml）即可完成對(duì)于多種參數(shù)的同時(shí)快速檢測。
圖4 使用ReactRaman™原位拉曼光譜儀建立的細(xì)胞培養(yǎng)過程葡萄糖濃度和活細(xì)胞密度的過程趨勢圖
發(fā)酵體系的原位監(jiān)測日益成為行業(yè)關(guān)注的方向。生物反應(yīng)器廣泛用于整個(gè)生物制藥行業(yè)，例如單克隆抗體的制造。在發(fā)酵過程中細(xì)胞代謝水平可能隨時(shí)發(fā)生波動(dòng)，代謝物水平可能會(huì)明顯改變，取樣分析帶來的滯后性會(huì)錯(cuò)過這些過程的表征。
ReactRaman™ 802原位拉曼光譜儀可輕松與生物反應(yīng)器整合。只需將探頭插入反應(yīng)器中，在高溫蒸汽滅菌之后，即可對(duì)發(fā)酵過程進(jìn)行全過程連續(xù)監(jiān)測。從過往研究與實(shí)際項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)來看，葡萄糖濃度、乳酸濃度、谷氨酸濃度、谷氨酰胺濃度、乳酸脫氫酶濃度，活細(xì)胞密度(VCD)、總細(xì)胞密度(TCD)、細(xì)胞活率(VIB)等多個(gè)指標(biāo)參數(shù)的在線監(jiān)測均可通過這種方法實(shí)現(xiàn)。
對(duì)于全過程的連續(xù)監(jiān)測提供了豐富的信息，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于取樣分析的數(shù)據(jù)量有助于提升我們對(duì)于發(fā)酵過程這一“暗室”的充分“可視化”，提升整個(gè)工藝的自動(dòng)化和數(shù)字化水平。理論上，ReactRaman™ 802原位拉曼光譜儀可以幫助避免發(fā)酵過程的任何異常情況，確保生物反應(yīng)器始終處于最優(yōu)的操作條件。工作人員借助實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)可做出快速?zèng)Q策，從而實(shí)現(xiàn)更高的產(chǎn)率和產(chǎn)品質(zhì)量。