骨髓作為主要的造血場所，可進行體外培養(yǎng)。在無菌條件下，把骨髓細胞分離出來，置于培養(yǎng)系統(tǒng)中，在合適的環(huán)境中，提供營養(yǎng)物質(zhì)，使其繼續(xù)生存或生長。通過培養(yǎng)骨髓，可見到造血干細胞不同分化階段時各種血細胞的前驅(qū)細胞。用通常的形態(tài)學方法不可能識別造血干細胞和各種血細胞的前驅(qū)細胞，但在加入各種造血因子的半固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)后，可出現(xiàn)單個前驅(qū)血細胞的增殖、分化，并形成細胞克隆。
一、材料
1．實驗動物小鼠(C57BL／6\B6D2Fl等)2只。
2．培養(yǎng)液瓊脂(Difco)、a—MEM、FBS(用新生牛血清、人血清也可)。
3．器具吸管、試管、注射器、25ml培養(yǎng)瓶、35mm塑料培養(yǎng)皿、血細胞計數(shù)器、解利用具、倒置顯微鏡、解剖顯微鏡。
4．試劑Turk液(白細胞稀釋液)。
二、方法
1．軟瓊脂培養(yǎng)液的制備將瓊脂30mg置于一試管中，加蒸餾水3ml，103．4kPa高壓滅菌，待冷卻至50℃～60℃時加2倍濃度的a-MEM等量混合，置于42℃水浴中保溫。
2．取材小鼠經(jīng)麻醉處死，全身浸泡于75％乙醇中消毒5min，拎出后將小鼠仰面翻鋪于超凈臺上一個消毒托盤上。用眼科鑷小心捏起小鼠兩髖關(guān)節(jié)之間的腹部皮膚，用眼科剪小心剪開皮膚，并分離兩下肢的皮膚，往下在腳踝處剪斷，往上在髖關(guān)節(jié)處剪斷，這樣可以游離出小鼠的兩條下肢。將它們放入另外一個消毒托盤中，并換一套新的剪子和鑷子。手術(shù)器械事先均必須消毒。
3．骨髓細胞的制備剝離肌肉，切除兩側(cè)股股，去除周圍肌肉組織后放人35mm塑料培養(yǎng)皿中，切除兩側(cè)骨的端部，用吸有a—MEM培養(yǎng)液的注射器沖壓出骨髓于一短試管中，霜10ml吸管吹打骨髓團塊后放置10min，將懸浮的細胞移植到另一試管中。取細胞懸液0.1ml與Turk液O．9ml混合，用血細胞計數(shù)器計數(shù)有核細胞數(shù)。根據(jù)計數(shù)，用a—MEM將骨髓細胞濃度稀釋成5×105／ml。
4．細胞接種取骨髓細胞懸液0．5ml、條件培養(yǎng)液O．5ml及FBS lml，混合于無菌試管中：加42℃軟瓊脂培養(yǎng)液3ml，迅速混合后移至35mm塑料培養(yǎng)皿中，使整個平皿底部鋪平(注意：此操作的動作要快，溫度不能太低，瓊脂不能在未分裝前就凝固于試管中)。靜置10min后瓊脂板可*凝固，置37℃、5％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)7d。
5．顯微鏡觀察與克隆計數(shù)低倍率(40～100倍)的倒置顯微鏡或解剖顯微鏡下計數(shù)克隆數(shù)，含有50個以上的細胞計數(shù)一個克隆，正常骨髓的發(fā)生率為100～200個／105個骨髓細胞。
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