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上海申知心生物科技有限公司
主營產(chǎn)品： 高血脂癥動物模型,心血管疾病動物模型,缺血性心臟病動物模型 |
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2018-3-30 閱讀(2602)
自身免疫性內(nèi)耳病動物模型
(1)復(fù)制方法 取4周齡近交系雄性C57BL/6小鼠，以及體重為300～400g，經(jīng)檢查耳郭反射正常，無中耳感染的豚鼠。豚鼠麻醉后心臟灌注，斷頭取顳骨，在4℃無菌含1mg/L抑肽酶的10mmol/L Tris緩沖液中剝離全部內(nèi)耳膜性組織，勻漿。勻漿液離心，取上清液-20℃凍存；沉淀在含0.5％十二烷基硫酸鈉、0.5％β-巰基乙醇、1％甘油、2mmol/ L苯甲丨基丨磺丨酰丨氟、10mmol/L N-己基順丁烯二甲亞胺的50mmol/L Tris緩沖液中勻漿，計算蛋白含量，-80℃分裝凍存。用制備的內(nèi)耳抗原(Inner Ear Antigen, IEAg)免疫小鼠，每只模型小鼠頸背部皮下多點注射IEAg弗氏佐劑(Complete Freund Adjuvant, CFA)乳劑，足背皮內(nèi)注射百日咳減毒活菌50μl(含25×1000000000個菌體)，IEAg含量為100μg。免疫后作小鼠雙側(cè)耳聽性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response, ABR)測試：動物麻醉后置聲、電屏蔽室內(nèi)，采用誘發(fā)電位儀測試。取刺激聲0.1ms為短聲，間隔時間為50ms，濾波100～3000Hz，掃描時間為10ms，疊加500次。低于刺激聲30dB的白噪聲對側(cè)耳作掩蔽。以波Ⅱ的反應(yīng)閾為標準判斷ABR的反應(yīng)閾。分別在造模后7、14、21、28d檢測動物血清中抗IEAg抗體，并取顳骨組織，制作內(nèi)耳組織常規(guī)切片，HE染色后，光鏡下觀察。
(2)模型特點 經(jīng)IEAg免疫后2周內(nèi)模型動物體重呈進行性下降，免疫3周后體重可恢復(fù)至免疫前水平，并緩慢增加；動物尚可出現(xiàn)活動減少、耳廓反射不敏感、走路不穩(wěn)等臨床表現(xiàn)。造模前C57BL/6小鼠ABR反應(yīng)閾均值為46dB SPL，左、右耳無顯著性差異；造模后第7日動物ABR反應(yīng)閾即顯著提高。模型動物鏡下病理組織學觀察顯示，內(nèi)耳組織中鼓階、蝸管、前庭階及蝸軸血管周圍有較多炎癥細胞浸潤，造模后前2周可見較多內(nèi)淋巴積水；并可見螺旋神經(jīng)節(jié)細胞腫脹及壞死樣改變，細胞數(shù)量在免疫后進行性減少。本模型應(yīng)用豚鼠IEAg造模后，且模型動物聽力改變與細胞浸潤程度及血清抗IEAg抗體水平呈顯著性正相關(guān)，提示免疫和體液反應(yīng)在誘發(fā)自身免疫性內(nèi)耳病(autoimmune inner ear disease, AIED)時可能起重要作用。
(3)比較醫(yī)學 自身免疫性內(nèi)耳病在臨床上目前仍然發(fā)病機制不明，也無特異性實驗室檢查指標，且治療原則存在爭議、治療效果不理想。建立與臨床AIED相似的疾病動物模型，有助于闡明自身免疫性內(nèi)耳病的發(fā)病機制及分析內(nèi)耳的免疫調(diào)節(jié)治療效果。以往的研究報道大多數(shù)實驗性 AIED均以遠交系豚鼠作為實驗動物，采用初次系統(tǒng)免疫后多次加強免疫的方式，通過機體產(chǎn)生的自身抗體經(jīng)體液免疫介導(dǎo)免疫反應(yīng)而誘發(fā)。這些模型成功率較低(20％～50％)；聽力損害程度較輕(8～25dB)；內(nèi)耳病理改變不典型；多次加強免疫的實驗周期較長，增加了實驗中不確定因素對實驗結(jié)果的影響。由于遠交系動物在可重復(fù)性及免疫學分析的細節(jié)研究方面均較近交系動物差，所以這些模型并不能準確反映人類AIED的發(fā)病機制以及病理生理改變。本模型采用內(nèi)耳抗原免疫動物后出現(xiàn)顯著的聽力下降，聽力損害程度隨免疫進程而不斷加劇，血清中可檢測到抗內(nèi)耳組織的自身抗體，這些變化與臨床上AIED患者的表現(xiàn)一致；形態(tài)學上表現(xiàn)的血管周圍炎等特征性自身免疫性損害可進一步證實。 C57BL/6小鼠作為一種廣泛使用的近交系小鼠，其個體間極為一致，且對實驗反應(yīng)也一致，可以消除雜合遺傳背景對實驗結(jié)果的影響。C57BL/6小鼠隨年齡增加可表現(xiàn)出與高頻相關(guān)的老年性聽力下降，因此這種動物模型被用于研究老年性耳聾。采用本方法誘導(dǎo)的AIED模型，具有發(fā)病率高，聽力損害程度嚴重，內(nèi)耳病理改變典型，造模周期短，制作方法簡便，實驗條件比較簡單，其他因素容易控制的優(yōu)點。
