細(xì)胞培養(yǎng)污染的途徑、危害及預(yù)防措施

污染是細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中面臨的主要問題。某些污染的發(fā)生往往難以察覺檢測，而且污染源能長期共存于培養(yǎng)體系中，這類染事實(shí)上大部分被人們忽視了。
培養(yǎng)的細(xì)胞作為個生物體，會對培養(yǎng)環(huán)境以及環(huán)境中的污染物作相應(yīng)的反應(yīng)，造成培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的改變，而實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成潛在的威脅，而且隨著污染時間的長而增加。
培養(yǎng)環(huán)境中的物理、化學(xué)及生物因素都可能入培養(yǎng)環(huán)境造成污染。由于入侵的微生物在培養(yǎng)系中不斷增殖、代謝，因此生物性的污染對細(xì)胞的害zui大。隨著污染微生物的不斷增殖，交叉污染可能性也不斷增加。此外，微生物代謝消耗大量需的養(yǎng)分，同時產(chǎn)生多種有毒的代謝產(chǎn)物，如酶、抗原及毒素等，進(jìn)一步對細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用。因此，識細(xì)胞培養(yǎng)污染的途徑及其危害性，建立細(xì)胞培規(guī)范的操作方法及規(guī)章制度，可以有效地防止污染保證實(shí)驗(yàn)體系的穩(wěn)定性和可靠性。
1 細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)
為了減少污染對細(xì)胞培養(yǎng)的影響，必須建立細(xì)胞凍存庫。細(xì)胞凍存庫應(yīng)該分主細(xì)胞庫(Master cell bank，MCB)和工作細(xì)胞庫(Working cell bank，WCB)，當(dāng)需要做實(shí)驗(yàn)時從主細(xì)胞庫中復(fù)蘇細(xì)胞建立工作細(xì)胞庫。每一個凍存標(biāo)本都應(yīng)明確記錄細(xì)胞的性質(zhì)、代數(shù)及有無污染。同時還應(yīng)建立規(guī)范的檢測程序進(jìn)行菌檢及細(xì)胞鑒定。
為了保證培養(yǎng)細(xì)胞系的完整性，必須進(jìn)行詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)記錄，應(yīng)包括以下內(nèi)容:細(xì)胞系的種類及來源、有無污染(如細(xì)菌，病毒，支原體)、細(xì)胞代數(shù)和倍增時間、以及選擇性突變。詳細(xì)的記錄有利于對細(xì)胞的遺傳及生理特性在常規(guī)傳代培養(yǎng)中因突變、污染及各種原因?qū)е碌母淖冞M(jìn)行分析。經(jīng)過連續(xù)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞與它較早代數(shù)的凍存細(xì)胞相比，隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞在適應(yīng)環(huán)境的過程中，其生物特性已發(fā)生了改變。培養(yǎng)的細(xì)胞由若干生長速度及活力各異的亞群組成。隨著培養(yǎng)時間的延長生長速，度快及活力高的細(xì)胞亞群逐漸占優(yōu)勢這種選擇性，趨勢會影響整個細(xì)胞群的生物特性。應(yīng)用不同代數(shù)的細(xì)胞連續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)則結(jié)果會發(fā)生偏差。建立細(xì)胞凍存庫就能避免這種影響通過復(fù)蘇相同代數(shù)的細(xì)胞，人們就能在較為均一的條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
細(xì)胞培養(yǎng)工作需要清潔，保持良好的環(huán)境及規(guī)范的操作程序。超凈工作臺是細(xì)胞培養(yǎng)中普遍使用的無菌操作裝置，它需要合理的布置及經(jīng)常性的維護(hù)。超凈工作臺的工作原理是驅(qū)動經(jīng)濾菌凈化后的空氣，通過工作臺面形成氣流屏障，從而阻止外界污染物的侵入并使操作過程中產(chǎn)生的飛沫限制在超凈工作臺中。因?yàn)椴僮鬟^程中可能產(chǎn)生有毒的物質(zhì)，所以采用垂直氣流比水平氣流安全。
當(dāng)進(jìn)行移液，傾倒液體的操作過程會產(chǎn)生飛沫并沉積在超凈工作臺內(nèi)物體的表面。超凈工作臺的氣流并不能阻止飛沫的產(chǎn)生，飛沫會隨著氣流的方向飄浮。超凈工作臺不合理的放置、不恰當(dāng)?shù)木S護(hù)以及不規(guī)范的使用會破壞超凈工作臺氣流的方向?qū)е嘛w沫更廣泛的沉積。酒精燈的火焰、操作者的活動、談話、咳嗽及打噴嚏都有可能影響氣流。飛沫的沉積是導(dǎo)致超凈工作臺內(nèi)物品污染的主要因素造成潛在污染的進(jìn)一步傳播。因此為減少交叉污染的發(fā)生，應(yīng)盡可能減少超凈工作臺內(nèi)的物品。不同細(xì)胞系以及同一個實(shí)驗(yàn)室不同操作者所使用的培養(yǎng)試劑一定要分開使用，如胰酶、培養(yǎng)液等。否則，一個操作者的失誤可能引起所有細(xì)胞發(fā)生污染。
2　細(xì)胞培養(yǎng)的污染
細(xì)胞培養(yǎng)污染是指培養(yǎng)環(huán)境中侵入了對細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞變異的異物。細(xì)胞培養(yǎng)污染可分為以下三類：物理性、化學(xué)性及生物性。為了使細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果更可靠，應(yīng)該固定所有培養(yǎng)條件，并保證其重復(fù)性。
2.1　物理性污染的來源、危害及預(yù)防　物理性污染常常被人們所忽視或被籠統(tǒng)地歸為化學(xué)性污染。物理性污染通過影響細(xì)胞培養(yǎng)體系中的生化成分，從而影響細(xì)胞的代謝。培養(yǎng)環(huán)境中的物理因素，如溫度、放射線、振動、輻射(紫外線或熒光)會對細(xì)胞產(chǎn)生影響。細(xì)胞、培養(yǎng)液或其它培養(yǎng)試劑暴露于放射線、輻射或過冷過熱的溫度中，可以引起細(xì)胞代謝發(fā)生改變，如細(xì)胞同步化、細(xì)胞生長受抑制甚至細(xì)胞死亡。通過實(shí)驗(yàn)室的合理設(shè)計(jì)及建立規(guī)范的操作規(guī)程，可以減少環(huán)境中物理因素對細(xì)胞的影響。孵箱應(yīng)放在溫度較恒定的環(huán)境中，周圍不能放置能引起機(jī)械振動的設(shè)備，如離心機(jī)。培養(yǎng)液及培養(yǎng)試劑應(yīng)放在固定的位置，為避免光照試劑不能放在玻璃門的冰箱中，試劑周圍不能放同位素。培養(yǎng)液從冰箱中取出后應(yīng)在室溫中放置一段時間后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以避免過冷的溫度對細(xì)胞的影響。
2.2　化學(xué)性污染的來源、危害及預(yù)防
培養(yǎng)環(huán)境中許多化學(xué)物質(zhì)都可以引起細(xì)胞的污染?；瘜W(xué)物質(zhì)并不總是抑制細(xì)胞的生長，某些化學(xué)物質(zhì)如激素就可促進(jìn)細(xì)胞的生長。不同細(xì)胞對化學(xué)物質(zhì)污染的反應(yīng)是不一樣的。未純化的物質(zhì)、試劑、水、血清、生長輔助因子及儲存試劑的容器都可能成為化學(xué)性污染的來源。細(xì)胞培養(yǎng)的必需養(yǎng)分，如氨基酸，若濃度超過了合適的范圍，也會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性。同樣，不同細(xì)胞系其*培養(yǎng)條件下對血清和緩沖液的要求是不一樣的，在培養(yǎng)中應(yīng)嚴(yán)格控制。玻璃制品清洗過程中殘留的變性劑或肥皂(通常殘留在瓶蓋的內(nèi)表面)是zui常見的化學(xué)性污染。
2.2.1　水　水是*一種在凝固時膨脹的化合物。因此在選擇凍存細(xì)胞的容器時應(yīng)考慮到這個因素。容器因水的膨脹而發(fā)生破裂是引起試劑污染的重要原因。為了避免金屬離子、有機(jī)分子、細(xì)胞內(nèi)毒素等物質(zhì)對水的污染，在配制液體，清洗容器時必須使用不含雜質(zhì)的超純水。需要注意的是，超純水放置過久其純度會下降。
在高壓蒸氣滅菌及蒸餾水時水經(jīng)常被污染，因?yàn)楦邏赫魵忮伡凹兯畽C(jī)的常規(guī)維護(hù)后可能有少量的化學(xué)物質(zhì)殘留。為了保證水的純度，我們應(yīng)采取措施盡量避免化學(xué)物質(zhì)的殘留。
2.2.2　血清　動物血清是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的天然培養(yǎng)基，但血清又是潛在的生物及化學(xué)污染的來源。由于血清采集于多個動物，而且不同廠商的生產(chǎn)工藝及質(zhì)量各不相同，因此血清中許多成分的濃度存在很大的變異。血清對不同細(xì)胞的促生長能力及毒副作用取決于這些細(xì)胞的分化功能、組織來源及培養(yǎng)基的成分等因素。在進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)時，為了保證實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，選用同一批次的血清。
2.2.3　培養(yǎng)液、培養(yǎng)附加成分、試劑　培養(yǎng)液、培養(yǎng)附加成分、試劑都可能成為化學(xué)性污染的來源。細(xì)胞培養(yǎng)使用的所有物質(zhì)都應(yīng)是高純度的，并經(jīng)過機(jī)構(gòu)的鑒定，實(shí)驗(yàn)者本人也應(yīng)對上述成分進(jìn)行純度鑒定。同時，正確配置和儲存培養(yǎng)液及試劑也是非常重要的，應(yīng)該采取標(biāo)準(zhǔn)的操作步驟，避免液體體積計(jì)算錯誤，混用類似化合物等錯誤。
2.2.4　培養(yǎng)器皿及容器　細(xì)胞培養(yǎng)過程中會使用到各種不同的培養(yǎng)器皿及容器。培養(yǎng)器皿的大小，構(gòu)形設(shè)計(jì)可能會影響到培養(yǎng)中氣體交換、濕度、培養(yǎng)液的pH值和細(xì)胞生長密度。培養(yǎng)器皿的工藝及滅菌過程中的差異可能對培養(yǎng)體系產(chǎn)生影響。塑料制品在生產(chǎn)過程中可能殘留一些有毒成形劑，生產(chǎn)工藝的不同可能引起器皿表面附著能力的不同。儲存不同物質(zhì)時應(yīng)選用合適的塑料或玻璃容器，因?yàn)榫凭?、?qiáng)酸、強(qiáng)堿能夠溶解塑料或玻璃的某些成分。
2.3　生物性污染的來源、危害及預(yù)防　外界的微生物如昆蟲、節(jié)肢動物、原蟲、霉菌、病毒、細(xì)菌、無細(xì)胞壁的微生物(通常指支原體)和其它類型的細(xì)胞都可能侵入培養(yǎng)環(huán)境引起污染。只要在一個開放的環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，都難以避免發(fā)生污染。發(fā)生污染的可能性取決于操作方法、培養(yǎng)室的無菌環(huán)境以及實(shí)驗(yàn)室的規(guī)章制度。生物性污染對細(xì)胞代謝的影響，可因污染源和細(xì)胞的種類不同而表現(xiàn)各異。細(xì)菌、真菌或其它微生物污染的檢測可以用不同培養(yǎng)基進(jìn)行檢查。支原體污染的檢測需要特殊的方法。病毒污染的檢測可以使用許多體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)，包括大鼠或小鼠的接種、逆轉(zhuǎn)錄酶分析、凝血試驗(yàn)、紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)等。
細(xì)菌和真菌的污染較易發(fā)現(xiàn)并及時清除，而大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室對支原體的污染缺乏足夠的認(rèn)識。為了防止支原體及其它微生物污染的發(fā)生和傳播，必須建立規(guī)范的無菌操作程序及各種規(guī)章制度。支原體歸屬
于柔膜體綱(Mollicutes)的支原體目，它們都具有以下共性:無細(xì)胞壁、無細(xì)胞壁主要成分———粘肽的表達(dá)。支原體與其它細(xì)菌不同之處還在于其胞膜中含有膽固醇或其它甾醇，這種特性使支原體膜更具柔順性，對于物理因素，如壓力、滲透壓、脫水的抵抗力很3大。支原體直徑僅有013～018μm，并且變形能力大，故能通過濾菌器。需要指出的是，只要有一個具有增殖能力的支原體就能引起培養(yǎng)體系的污染。一旦細(xì)胞被污染，支原體的滴度隨著時間的延長而逐漸升高，zui高可至每毫升10克隆。zui為致命的是，即使存在很嚴(yán)重的支原體污染，細(xì)胞外觀可無明顯變化。如果繼續(xù)使用這種已被支原體污染，而貌似正常的細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)，將會嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
2.3.1　來源　培養(yǎng)體系中支原體污染的zui可能途徑是經(jīng)已被支原體污染的細(xì)胞擴(kuò)散和傳播。細(xì)胞被支原體污染后，支原體可以與宿主細(xì)胞形成一個共生體系，使污染不斷擴(kuò)大。一旦發(fā)生支原體污染，支原體和其它微生物會隨著飛沫而不斷傳播。操作過程中移液，傾倒液體時都會產(chǎn)生具有潛在感染能力的飛沫，并沉積在接觸到的表面。這種污染性飛沫能存活數(shù)天甚至數(shù)星期。此外，操作失誤引起的交叉污染也是支原體污染的一個常見途徑。人體的組織及體液成分是細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的主要來源。污染的細(xì)胞中通常能分離到人類口腔支原體、發(fā)酵支原體、唾液支原體以及其它一些與人有關(guān)的支原體，如M.buccale，M.faucium，M.homo2nis，M.pirum和生殖支原體等。無菌操作過程中，操作者能產(chǎn)生有污染性的隨空氣傳播的飛沫和微粒，造成培養(yǎng)體系的污染。人體外周血、骨髓、淋巴組織原代培養(yǎng)中有可能發(fā)生發(fā)酵支原體的原發(fā)污染(primarycontamination)，這也證明支原體在分化細(xì)胞中較未分化細(xì)胞更易生長。隨著培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們已能培養(yǎng)來自不同物種如動物、植物、昆蟲的各種細(xì)胞，同時也擴(kuò)大了支原體及其它微生物的宿主范圍。此外，某些支原體，如菜氏無膽甾原體科(Acholeplasmalaidlawii)、M.arginini、M.hyorhinis、口腔支原體、唾液支原體能寄生不同的宿主，并能在培養(yǎng)體系中穩(wěn)定增殖數(shù)年。牛血清中能分離到A.laidlawii、M.arginini和M.hyorhinis支原體，因此血清可能成為支原體污染的來源。由于無血清培養(yǎng)基中許多附加成分及試劑是從血清或其它生物制品中制備的，因此無血清培養(yǎng)體系并不能排除支原體污染的危險。盡管隨著培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)步，血清發(fā)生污染的可能性進(jìn)一步降低，但只要有一個活的支原體能通過濾菌器，整個培養(yǎng)體系就會被污染。
2.3.2　危害　支原體通過產(chǎn)生代謝產(chǎn)物及消耗各種養(yǎng)分，如核酸前體及必需氨基酸，從而改變細(xì)胞的代謝狀態(tài)。支原體可以酵解糖，分解精氨酸，氧化丙酮酸，解脲支原體可以利用尿素作為能源，這會使細(xì)胞代謝發(fā)生一系列改變，從而影響蛋白質(zhì)、DAN、RNA合成以及嘌呤從頭合成及補(bǔ)償合成途徑。污染時間的長短及核酸代謝改變決定了支原體污染造成的危害程度，導(dǎo)致細(xì)胞染色體斷裂、重排、非整倍體的出現(xiàn)。隨后，細(xì)胞的生長特性發(fā)生改變，使某些酶和細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加，并表現(xiàn)出一些特殊的細(xì)胞功能，而其它一些細(xì)胞正常的功能則被抑制。某些支原體附著在細(xì)胞表面后，會與宿主細(xì)胞交換膜
抗原成分。隨著細(xì)胞膜成分的改變，細(xì)胞的形態(tài)及抗原性發(fā)生改變。細(xì)胞污染對研究工作帶來的zui大危害是由于錯誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果導(dǎo)致研究誤入歧途。此外，支原體污染還會干擾細(xì)胞的篩選，如雜交瘤細(xì)胞生長受到抑制并喪失產(chǎn)生單抗的能力。
2.3.3　預(yù)防及控制　污染發(fā)生后首先應(yīng)確定污染物的種類及污染的程度。為了能正確檢測細(xì)菌或支
原體的污染，應(yīng)先撤去培養(yǎng)液中的抗生素。常規(guī)細(xì)胞傳代培養(yǎng)中應(yīng)用抗生素會導(dǎo)致:①掩蓋了不很嚴(yán)重的污染;②導(dǎo)致了耐藥菌的產(chǎn)生。每一種抗生素的抗菌譜都是有限的，而且許多抗生素僅是抑制細(xì)菌生長，而非殺菌劑。因?yàn)橹гw無細(xì)胞壁，所以青霉素，頭孢菌素等干擾細(xì)胞壁合成的抗生素對于支原體無效。菌檢及支原體檢測只有在撤去抗生素后才能進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)中若發(fā)生污染或其它問題應(yīng)有詳細(xì)的記錄，并由經(jīng)驗(yàn)豐富的專家分析，找出哪個環(huán)節(jié)出了問題，包括培養(yǎng)液的配置、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的保持和無菌操作過程等，從而不斷完善操作規(guī)程，避免類似問題的現(xiàn)。此外，管理者還應(yīng)制定細(xì)胞培養(yǎng)的各項(xiàng)規(guī)章制度，教育每一個實(shí)驗(yàn)人員遵守。實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人應(yīng)根據(jù)情況，制定修改各項(xiàng)規(guī)范的操作程序及人員培訓(xùn)計(jì)劃。一般來說，隨著實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的擴(kuò)大，細(xì)胞發(fā)生變異和污染的可能性增加了。因此，大型實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格制定各項(xiàng)操作程序及規(guī)章制度。細(xì)胞培養(yǎng)中無菌操作需要清潔的工作環(huán)境、實(shí)驗(yàn)的合理安排、實(shí)驗(yàn)者熟練的操作技巧及強(qiáng)烈的責(zé)任感。只有通過不斷地學(xué)習(xí)、訓(xùn)練，才能熟練掌握無菌操作技術(shù)。為了盡可能減少污染的發(fā)生，以常規(guī)檢查的方式來監(jiān)督是必要的。細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)生污染是不可避免的，我們的目的是盡可能減少污染的發(fā)生及危害。
根據(jù)美國實(shí)驗(yàn)室的調(diào)查報(bào)告顯示，至少10%的細(xì)胞系存在支原體的污染。一旦發(fā)生污染，如果細(xì)胞有詳細(xì)的記錄，則污染引起的危害較小。我們可以根據(jù)細(xì)胞定期菌檢記錄拼棄zui后一次細(xì)胞菌檢陰，性后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。利用菌檢陰性的細(xì)胞重新開始實(shí)驗(yàn)。如果僅偶爾進(jìn)行菌檢或采用非特異檢測方法，尤其是支原體污染，那么確定污染的范圍比較困難。因?yàn)樗械募?xì)胞系都有可能被交叉污染。一旦發(fā)生污染，所有未進(jìn)行菌檢的凍存細(xì)胞都必須進(jìn)行菌檢，以去除污染的細(xì)胞并明確污染發(fā)生的時間。
2.3.4　檢測　由于支原體污染并不引起細(xì)胞外觀的明顯變化，故常規(guī)的支原體檢測非常必要的。人們可利用一系列直接或間接的方法檢測支原體。但由于支原體種類的多樣性，目前還沒有一種方便、廣譜、特異性高、準(zhǔn)確的檢測方法。因此，有必要對不同檢測方法的靈敏度及局限性有所了解。
不同檢測方法對送檢標(biāo)本的要求不同，如果標(biāo)本不合格，將不可能獲得正確的結(jié)果。血清、培養(yǎng)液或培養(yǎng)基附加成分在加工和儲存過程中污染會在一6定程度上被稀釋，影響檢出率。間接檢測法由于其敏感性較差，若不采用濃縮標(biāo)本，則不適用于檢測血清和培養(yǎng)液的污染。由于污染物的隨機(jī)分布，因此僅進(jìn)行一次檢測通常會出現(xiàn)假陰性。如果標(biāo)本中污染物濃度低于10個污染物/ml，隨機(jī)抽取1ml標(biāo)本進(jìn)行檢測可能有366%的假陰性率。增加1標(biāo)本體積，濃縮標(biāo)本有助于降低假陰性率。另一種假陰性的產(chǎn)生是由于污染物在試劑瓶，凍存瓶等容器中的分布不均所致。若20個樣品中有一個被污染(5%的污染率)，檢測所有20個樣品，假陰率為。需要指出的是僅僅單次檢測一個標(biāo)本來3616%，判斷有無生物性污染的作法是不可靠的。因此，在分裝液體前，就應(yīng)當(dāng)從原液中盡可能多取一點(diǎn)液體進(jìn)行檢測。如果不能做到這一點(diǎn)，則應(yīng)該用標(biāo)準(zhǔn)方法選擇多個標(biāo)本進(jìn)行檢測。例如，在無菌過濾操作中，隨著濾過體積的增大，濾膜破損的可能性增加，故應(yīng)選擇zui后過濾的液體進(jìn)行檢測。
標(biāo)本的處理與標(biāo)本的選擇同樣重要。各種酶如胰酶、脂酶，強(qiáng)酸，強(qiáng)堿或其它化學(xué)物質(zhì)會破壞支原體膜的脂質(zhì)，使支原體喪失活力及膜的完整性。膜的完整性被破壞后，支原體內(nèi)的蛋白酶及核酶釋放，從而會干擾間接檢測方法的結(jié)果。如果標(biāo)本收集后不能當(dāng)天檢測，則應(yīng)該盡快凍存標(biāo)本以防止降解。
選擇、處理檢測標(biāo)本的目的是盡可能發(fā)現(xiàn)潛在的污染。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中就應(yīng)考慮到支原體污染的檢測。我們選用無抗生素培養(yǎng)，檢測應(yīng)盡可能離傳代時間長一點(diǎn)，以便讓任何潛在的污染物生長、繁殖。為防止支原體活力喪失，如果檢測的是貼壁細(xì)胞，應(yīng)采用刮除細(xì)胞的方法，因?yàn)橐让富蚱渌蛛x方法會降低支原體的活性。在選用合適的檢測方法時，應(yīng)考慮到支原體的滴度和活力這兩個因素。直接培養(yǎng)法是zui敏感的，但也是zui耗時的檢測方法，大約需28天。從理論上講，只需一個有活力的支原體就能在培養(yǎng)基上生長。但某些難以培養(yǎng)的支原體限制了直接培養(yǎng)法的應(yīng)用。理想的直接培養(yǎng)法應(yīng)采用多功能的培養(yǎng)基，以降低假陰7性率。為增加對低滴度和低活力支原體檢出率，應(yīng)采用有氧和無氧兩種培養(yǎng)條件及幾種傳代方式。直接培養(yǎng)法還需要活性支原體作為陽性對照，而且耗時，操作繁瑣，因而不適于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室。檢測支原體污染的間接法包括:PCR、ELISA、電子顯微鏡檢查、DNA探針、DNA熒光染色及生化7分析法等。間接法能檢測到10/L的滴度。通常情9況下，支原體污染后其滴度一般超過10/L，故盡管間接法不敏感，但相對較。由于支原體的多樣，表達(dá)不同特異性的抗原及酶，為生化及免疫檢測8法帶來技術(shù)上的困難。在選擇PCR、DNA探針等方法前，應(yīng)考慮好選擇合適的靶序列及引物序列。DNA熒光染色法和直接培養(yǎng)法相結(jié)合是支原5體檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。美國、加拿大、日本和歐共體國家生物制藥及診斷的監(jiān)督機(jī)構(gòu)推薦使用這種方法。其基本原理在于利用不同的技術(shù)，多次檢測，以彌補(bǔ)各種檢測技術(shù)的缺陷，增加檢測結(jié)果的可信度。
2.3.5　控制及排除　控制支原體污染或其它生物性污染的*可靠的方法是所有可能污染的物品用高壓蒸氣滅菌法消毒。所有細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備都應(yīng)消毒，應(yīng)嚴(yán)格遵守上述的各項(xiàng)規(guī)章制度及監(jiān)督制度，直至所有潛在的污染源都被消除。細(xì)胞一旦被支原體污染，要將它清除是非常困難的。由于一些不可復(fù)得的細(xì)胞被污染，人們不得不設(shè)法清除污染，挽救一些珍貴的細(xì)胞。事實(shí)上，經(jīng)支原體污染的細(xì)胞，在污染經(jīng)處理被清除后，細(xì)胞原有的許多生物學(xué)特性，如基因的表達(dá)，抗原性和代謝特點(diǎn)也隨之發(fā)生了相應(yīng)的改變。排除支原體污染的方法，包括使用抗生素、抗血清、裸鼠體內(nèi)接種、巨噬細(xì)胞吞噬、胰酶消化等方法，但沒有一種方法是普遍有效的。所以在采用每一種方法時必須對其效果以及對細(xì)胞可能產(chǎn)生的毒性影響進(jìn)行監(jiān)測。Del6Guidice和Gardella提出了一個有效的方法，其基本步驟包括首先分離、鑒定污染物及測定對抗生素的敏感性，然后使用至少兩種敏感的抗生素進(jìn)行處理。為增加排除污染的有效性，可以通過稀釋以降低血清及其它促生長因子的濃度，從而降低細(xì)胞的密度。治療后細(xì)胞應(yīng)在無抗生素條件下培養(yǎng)若干代，以確定污染已被*清除。細(xì)胞培養(yǎng)過程中支原體污染不易察覺，細(xì)胞被支原體污染后清除非常困難，支原體污染的細(xì)胞在支原體被清除后，其細(xì)胞特性會發(fā)生很大改變，對研究結(jié)果造成嚴(yán)重影響因此，為了保證細(xì)胞培養(yǎng)體系免受污染的影響，關(guān)鍵是加強(qiáng)預(yù)防措施。