冷凍干燥中的保護劑

冷凍干燥簡稱凍干是將需要干燥的藥物溶液預先凍結成固體然后在低溫低壓條件下從凍結狀態(tài)不經過液 態(tài)而直接升華除去水分的一種干燥方法由于整個操作過程都處于低溫狀態(tài)故這種方法尤其適用于熱敏性蛋白質藥物制劑的制備。而凍干后的蛋白質藥物呈疏松狀餅塊樣，不僅有利于保存而且有利于蛋白質藥物重溶后的復性。顯然，凍干技術為理化性質不穩(wěn)定的蛋白質藥物制劑提供了一種有效的制備方法然而凍干過程是一個復雜的相變過程，在凍結、凍融、干燥和儲存過程中存在著多種誘導藥品中蛋白質變性的因素，故常需使用一些保護劑來穩(wěn)定處方中的蛋白質。凍干保護劑的種類繁多，機制復雜，為了對此有更深入細致的了解，更為合理的使用這些輔料及制備出高質量的凍干產品，本文就近年來國內外學者對蛋白質凍干制品保護劑作一綜述。

凍干制品的整個凍干過程存在著各種各樣的應力，通常包括低溫應力、凍結應力（包括枝狀冰晶的形成、離子強度的增加、PH值的改變、相分離等）、干燥應力（移去蛋白質表面單層水分子）等，這些應力常常是直接或間接導致蛋白質藥物不穩(wěn)定的因素。根據保護劑對抗應力的不同可把蛋白質保護劑初步分為冷凍保護劑和凍干保護劑。一個優(yōu)良的蛋白質保護劑不僅能夠在整個凍干過程中對蛋白質藥物起到良好的保護作用，而且能夠對成品貯藏期內蛋白質藥物的變性起到抑制作用，因為蛋白質藥物在貯藏期的變性率往往比在凍干過程中的變性率要大，然而，多數在溶液中很有效的蛋白質冷凍保護劑種類對干燥態(tài)的蛋白質并無保護作用，甚至還會加速蛋白質藥物的不穩(wěn)定化，例如，在PH5的10mmol/L醋酸鈉溶液中，加入CaCl2能能夠提高胰膚酶的穩(wěn)定性，但同時會增加蛋白質凍干餅塊的塌陷及蛋白質活性的丟失。而在干燥過程中對蛋白質起保護作用的保護劑也可能對冷凍狀態(tài)下的蛋白質起不到任何保護效果，為了擴大保護作用，常常需要在凍干制品中使用兩種類型以上的保護劑常用的保護劑種類有多羥基化合物、糖、蛋白質、聚合物、氨基酸、鹽、胺、表面活性劑等。

1、多羥基化合物

多羥基化合物用作蛋白質的抗凍劑由來已久，常見的該類凍干保護劑有甘油、甘露醇、山梨醇、肌醇、硫醇、聚乙二醇等。甘油可促進凍干處理的過氧化氫酶復性，且隨著甘油濃度上升至0.8%時過氧化氫酶能*復性。甘露醇不僅可作為優(yōu)良的骨架劑使用，而且在一些處方中它能夠兼作蛋白質的凍干保護劑。甘露醇對蛋白質的保護作用與其濃度、形態(tài)結構有關，而其濃度與結晶形態(tài)有時呈一定的關聯(lián)性。通常認為無定型甘露醇具有使蛋白質穩(wěn)定的作用而結晶態(tài)的甘露醇則失去保護功能；1%或更低濃度的甘露醇通過無定型結構的形成而阻止蛋白質藥物的聚集，但是高濃度的甘露醇則易于形成結晶態(tài)而促進蛋白質藥物的聚集。

2、糖

糖是zui常見、使用zui廣的一類凍干保護劑，是蛋白質的非特異性穩(wěn)定劑，在凍干的各個階段（如冷凍、凍融及升華干燥等）均能對蛋白質藥物起到一定的保護作用。糖的保護作用與其及蛋白質的種類有關，而雙糖是研究zui多也*zui有效的保護劑，其中蔗糖是由一分子葡萄糖及一分子果糖所構成的雙糖，化學性質穩(wěn)定，多呈無定型結構，對阻止蛋白質二級結構改變、凍干處理過程中及貯藏期內蛋白質的伸展和聚集起顯著作用。與蔗糖相比，海藻糖具有更高的玻璃化溫度、更低的引濕性、更不具有還原性，這些優(yōu)點均預示著海藻糖可能具有更廣闊的應用前景。大分子糖對蛋白質提供的保護作用似乎不及小分子糖 諸多的研究均顯示分子量大的多糖不是凍干保護劑的*選擇。但有些研究結果卻與此相反，如對大分子量菊糖的研究表明聚合度高于5.5-6.0的的菊糖對堿性磷酸酶的活性保護作用明顯高于海藻糖及低聚合度的菊糖。這說明對多糖的保護作用不能一概而論。特別是在儲藏期，右旋糖酐等多糖可提高制品的玻璃化溫度，阻止因制品塌陷而誘導蛋白質破壞。葡萄糖在凍干過程中可部分保持無定型，對某些蛋白質藥物具有一定的保護作用，但應該注意的是葡萄糖系還原性糖在選其作為蛋白質的保護劑時要慎重。糖對蛋白質保護作用大小有時依賴于其濃度，通常在某個濃度范圍內糖的保護作用隨著濃度的升高而增大；當達到某一濃度時保護作用達到zui大值，而此后再增大糖的濃度則保護效果不再顯著增加，有時反而會降低。對呈現(xiàn)zui大保護作用時糖的濃度其報道不一，如100mmol/L蔗糖對B-半乳糖配酶的保護效果，而對磷酸果糖激酶提供zui大保護作用的海藻糖濃度為300mg/ml，文獻報道糖獲得zui大穩(wěn)定作用的zui低濃度是其足夠在蛋白質表面形成一個單分子層的濃度，實際上，糖對蛋白質的保護作用不僅取決于糖的總體濃度而且還與兩者的比例有關，有人研究發(fā)現(xiàn)a-D-吡喃甘露糖乳糖、海藻糖、纖維二糖等與重組人生長激素的摩爾比為131：1時它們均能100%地占據重組人生長激素上強及弱的水結合位點，對其提供*的保護效果，當摩爾比達300：1及1000：1時糖對重組人生長激素的保護作用不再提高且在某些處方中保護作用甚至會有所下降。

糖的還原性及其它性質（如旋光性）也會影響其對蛋白質的保護作用。葡萄糖、乳糖、麥芽糖、纖維二糖等還原性糖均有可能與蛋白質上暴露的某些氨基酸殘基發(fā)生邁拉德反應（即撥氨反應或棕色反應），使制品變黃和蛋白質活性降低，旋光性不同的麥芽糖糊精在凍干過程中對乳酸脫氫酶的保護作用顯示出很大差異。

目前用作蛋白質保護劑的糖有葡萄糖、a-D-吡喃甘露糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、纖維二糖、甘露糖、麥芽糖、肌糖、棉白糖、菊糖、右旋糖酐、麥芽糖糊精、麥芽多糖、八硫酸蔗糖、肝素、2-羥丙基-B環(huán)糊精等。盡管糖能夠對多數蛋白質提供可靠的保護作用，但并非所有的蛋白質都能被糖所保護，這仍有待于更為細致深入的研究。

3、氨基酸

氨基酸是常見的蛋白質保護劑之一，在冷凍過程中低濃度的甘氨酸可通過抑制10或100mmol/L磷酸緩沖鹽結晶所致PH值的改變而阻止蛋白質藥物變性。無定型甘氨酸可阻止凍干過程中重組人生長激素的聚集；結晶型甘氨酸能升高成品的塌陷溫度阻止因塌陷而引起的蛋白質藥物的破壞常用的氨基酸類蛋白質保護劑有脯氨酸、色氨酸、谷氨酸鈉、丙氨酸、甘氨酸、賴氨酸鹽酸鹽、肌氨酸、L-酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等。

4、聚合物

聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、明膠、聚乙烯亞胺等聚合物也常用作為蛋白質的冷凍保護劑。通常聚合物的穩(wěn)定作用取決于聚合物的多重性質，如優(yōu)先從蛋白質表面析出、表面活性、使蛋白質溶液黏度升高從而阻止其他小分子（如糖及多輕基化合物）的結晶、抑制冷凍過程中PH值的劇烈變化等。不同聚合度及濃度的聚合物所提供的保護作用不同，如聚合度大的PVP有著較高的玻璃化溫度，隨著PVP濃度及分子量增加，水溶液的黏度隨之變大，蔗糖的玻璃化溫度明顯升高，對冷凍過程中的蛋白質所起的保護作用隨之也有所增加；但聚合度過大時，聚合物會在冷凍過程中結晶，從而失去對蛋白質的保護作用，而且濃度及分子量過大時會增加zui終產品的水分，使得制品中蛋白質變得更不穩(wěn)定。右旋糖酐40對豬的胰蛋白酶穩(wěn)定作用比右旋糖酐80強，提示聚合物合適的鏈長有利于胰蛋白酶的穩(wěn)定。

5、蛋白質

蛋白質類保護劑可分為兩種：一種是蛋白質藥物自身，另一種為外來蛋白質。一些蛋白質經凍融后的活性直接和蛋白質的起始濃度有關，起始濃度升高有時會促進蛋白質的復性。一種常用的外來蛋白質類保護劑為血清白蛋白，它是一個經典、優(yōu)良的蛋白質穩(wěn)定劑。例如，冷凍時1% 牛血清白蛋白可使兔肌肉乳酸脫氫酶水溶液的活性不受損失；人血清白蛋白則在更低濃度（0.05%-0.1%）時也能有效阻止蛋白質表面的吸附，對凍干過程中多數蛋白都具有保護作用，因而常用于白細胞介素、巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）等疏水性細胞因子凍干處方中。然而，由于血清白蛋白潛在的血源性病原體污染限制了其在蛋白產品中的應用。已有人把重組人白蛋白推薦為血清白蛋白的替代品。

6、其它

吐溫80、布里杰、普朗尼克及十二烷基磺酸鈉等一些表面活性劑有時對冷凍及干燥過程中的蛋白質起到一定的保護作用。在某些凍干制品中，加入鹽和胺可獲得特定的蛋白質穩(wěn)定化效果。聯(lián)合使用不同類型的保護劑可獲得穩(wěn)定性更佳的凍干制品。

如何獲得穩(wěn)定的蛋白質凍干制品，選擇適宜的保護劑至關重要。那么如何去選擇適宜的保護劑呢？首先要對被保護的蛋白質藥物理化特性有一個充分的了解，繼而再通過試驗摸索出在凍干過程及貯藏過程中導致該蛋白質藥物不穩(wěn)定的因素，然后針對這些不穩(wěn)定因素選擇具體的保護劑一般而言，糖及多羥基化合物是zui常用的凍干保護劑，其中蔗糖 海藻糖等雙糖對一些蛋白質均能顯示出良好的保護作用，故在選擇凍干保護劑時應優(yōu)先考慮。一個優(yōu)良的凍干保護劑應該具備多種保護特性，如高的玻璃化溫度 低的吸濕性能 低的結晶速率 及不具有還原性基團等。但任何單一保護劑都不可能具有所有的保護特性，因此有時還得考慮使用2種或2種以上的保護劑來穩(wěn)定蛋白質藥物。

結 語

隨著生物技術的飛速發(fā)展，越來越多的蛋白質藥物被開發(fā)出來。截至目前為止除了采用凍干技術外尚無更有效的制劑手段可用來制備較為穩(wěn)定的蛋白質產品，即便采用凍干技術制備某些蛋白質產品仍需要采取一些有效的輔助手段，如加入凍干保護劑以增加蛋白質的穩(wěn)定性。近些年來凍干保護劑及其保護機制研究更加深入。特別是蛋白質分析手段的提高為蛋白質保護劑的研究提供了方便，計算機技術在凍干過程中的應用使得能夠建立相應的數學模型對凍干過程中物料的真實狀態(tài)進行模擬解析，從而也使得凍干技術得以完善與提高。但蛋白質的穩(wěn)定機制相當復雜，對蛋白質凍干制品的研究有待進一步的深化。開發(fā)更*的凍干保護劑，提高蛋白質藥物凍干制品的質量仍是現(xiàn)今生物技術藥物研究的重點與方向。