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Cell Counting Kit-8 (CCK-8試劑盒)，是一種基于WST-8（化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）而廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速、高靈敏度的比色檢測(cè)試劑盒。檢測(cè)原理為：WST-8在電子耦合劑1-Methoxy PMS存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的水溶性的甲臜（formazan，參考圖1)，生成的甲臜的顏色深淺與細(xì)胞增殖成正比，與細(xì)胞毒性成反比。使用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)處測(cè)定OD 值，間接反映活細(xì)胞數(shù)量。本產(chǎn)品可用于細(xì)胞增殖測(cè)定，細(xì)胞毒性的檢測(cè)，藥物篩選，以及細(xì)胞生長(zhǎng)抑制檢測(cè)等。

CCK-8法的優(yōu)勢(shì)

運(yùn)輸與保存
藍(lán)冰運(yùn)輸。-20℃保存，有效期24個(gè)月。【注】：反復(fù)凍融會(huì)造成測(cè)定背景OD值升高。
使用方法

1. 以96孔板為例，96孔板中每孔接種100 μL的細(xì)胞懸液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h。
   

2. 向每孔加入10 μL不同濃度的待測(cè)物質(zhì)。如果僅測(cè)定細(xì)胞活性，則不需要2~3步驟，直接從第四步操作。
   

3. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間 (依據(jù)待測(cè)藥物而定)。
   

4. 向每孔加入10 μL CCK-8溶液 (注意不要產(chǎn)生氣泡，輕輕混勻)。
   

5. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育適當(dāng)時(shí)間（一般0.5~2 h）。
   

6. 酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光值。

注意事項(xiàng)

1. 本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。
   

2. 建議調(diào)試合適的接種細(xì)胞的數(shù)量和加入CCK-8溶液后培養(yǎng)的時(shí)間。當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96 孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞至少1000 個(gè)/ 孔(100 μL 培養(yǎng)基)，白細(xì)胞至少2500 個(gè)/ 孔(100 μL 培養(yǎng)基)。建議實(shí)驗(yàn)前設(shè)定幾個(gè)不同細(xì)胞數(shù)量的梯度孔進(jìn)行條件測(cè)試，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間和處理方法根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況而定，加入CCK-8溶液后（加入體積為每孔細(xì)胞培養(yǎng)液體積的10%），在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，不同時(shí)間點(diǎn)后測(cè)450 nm處的吸光值(CCK-8敏感性高，一些細(xì)胞0.5 h后就可以測(cè)定第一次)。
   

3. CCK-8試劑盒的檢測(cè)依賴于脫氫酶催化反應(yīng)，如果待檢測(cè)體系中有較多還原劑（或抗氧化劑）會(huì)造成背景OD值升高，干擾檢測(cè)結(jié)果。如果實(shí)驗(yàn)中有還原劑，請(qǐng)檢查背景的OD值，設(shè)法先去除還原劑干擾。例如，可在加入CCK-8溶液之前更換新鮮的培養(yǎng)基，以去除待測(cè)藥物的影響。當(dāng)待測(cè)藥物影響比較小時(shí)，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入待測(cè)藥物后的空白吸收即可。
   

4. 進(jìn)行藥物抑制實(shí)驗(yàn)時(shí)，如果藥物中含有金屬，如Pb2+、Fe2+、Cu2+等金屬會(huì)對(duì)CCK-8 Solution的顯色反應(yīng)產(chǎn)生影響，從而導(dǎo)致檢測(cè)的靈敏度降低。
   

5. 如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化，應(yīng)洗滌細(xì)胞更換培養(yǎng)基后再加CCK-8檢測(cè)。細(xì)胞培養(yǎng)基酚紅不影響測(cè)定結(jié)果。
   

6. 為使CCK-8試劑盒培養(yǎng)基充分混勻，減少CCK-8在移液器上的殘留，建議加樣前用培養(yǎng)基稀釋CCK-8試劑，混勻后加樣。
   

7. 若暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以向每孔中加入0.1 M 的HCL 溶液或者1% w/v SDS 溶液，室溫避光保存，24 h 內(nèi)檢測(cè)，吸光度不會(huì)受到影響。(加入1% SDS 溶液的體積與加入CCK-8溶液的體積相同)。
   

8. 如果吸光值很低，可以適當(dāng)增加細(xì)胞數(shù)量或者延長(zhǎng)加入CCK-8溶液后孵育的時(shí)間。
   

9. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。