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Protein A/G瓊脂糖凝膠通常用于從血清、細(xì)胞培養(yǎng)上清或腹水中分離抗體，以及從細(xì)胞或組織提取物中分離抗原進(jìn)行免疫沉淀和免疫共沉淀。蛋白A/G瓊脂糖偶聯(lián)高質(zhì)量的重組蛋白A/G，它可以結(jié)合抗體的IgG結(jié)合域,這些結(jié)構(gòu)域可以與許多不同物種的抗體結(jié)合，包括小鼠、人、兔、豬、狗和貓。

訂購信息

常溫運輸。4℃保存，有效期24個月。

技術(shù)參數(shù)

懸浮細(xì)胞樣品

1.4℃、500-1000 g、10 min，收集細(xì)胞，棄上清。

2.用PBS 洗細(xì)胞一次，即用 PBS 將細(xì)胞團(tuán)重懸，4℃、500-1000 g、10 min，收集細(xì)胞，棄上清。

3.用預(yù)冷的IP Lysis/Wash Buffer重懸細(xì)胞。每50mg 細(xì)胞使用500μL IP Lysis/Wash Buffer。同時加入PMSF等相應(yīng)的抑制劑，混勻后置于冰上靜置5-20 min（期間混勻幾次）。

4.4 ℃, 12000 -16000 g,10 min離心收集上清液，置于冰上以備后續(xù)實驗（或置于-80 ℃長期保存）。

血清樣品

一般建議建議用IP Lysis/Wash Buffer稀釋血清樣品至目標(biāo)蛋白終濃度為50~150 µg/mL，置于冰上備用（或置于-20 ℃長期保存）。

免疫復(fù)合物的制備

【注】：樣品所需的量和孵育時間均依賴于每個特定的抗體-抗原體系，因而可能需要優(yōu)化才能得到最大產(chǎn)量。

以下實驗方案針對2-10μg 親和純化的抗體，根據(jù)需要可以按比例放大。

1.在離心管中，將每個樣品的細(xì)胞裂解液與2-10μg 免疫沉淀抗體結(jié)合。每個免疫沉淀反應(yīng)推薦的總蛋白量為500-1500μg。

2.用IP Lysis/Wash Buffer將抗體以及制備好的樣品稀釋至300-500μL。

3.在室溫下孵育1-2 h，或4 ℃過夜，以形成免疫復(fù)合物。

免疫沉淀

【注】：為保證微球均勻分布，使用前通過反復(fù)顛倒或輕微渦旋混勻瓶中微球。

1.將25µLProtein A/G瓊脂糖加入1.5 mL 離心管中。

2.向離心管中加入500 µL 預(yù)冷PBS，輕柔混勻。

3.然后4℃、1000g離心5min,去除上清。

4.向離心管中加入200-500 µL IP Lysis/Wash Buffer。顛倒離心管數(shù)次或輕微渦旋混勻1min。4℃、1000g離心5min,去除上清。

5.將抗原樣品/抗體混合物加入裝有Protein A/G瓊脂糖的離心管中，保持混勻室溫下孵育1-2 h，或4℃過夜。

6.4℃、1000g離心5min，除去未結(jié)合的樣品，保存以備分析。

7.向離心管中加入500 µL IP Lysis/Wash Buffer，輕柔混勻。4℃、1000g離心5min收集瓊脂糖，棄上清。再重復(fù)洗兩次。

8.向離心管中加入80-100 µL SDS-PAGE Sample Loading Buffer（1×），將樣品置于100℃水浴或者金屬浴中加熱10 min。離心后，保留含有目的抗原的上清。

注意事項

1.本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。

2.請勿高速離心、干燥或冷凍磁珠，這些操作會導(dǎo)致微球聚集而降低結(jié)合能力。

3.IP實驗中不同類型的抗體與抗原結(jié)合的親和性是有區(qū)別的，抗體與抗原結(jié)合還會受到IP Lysis/Wash Buffer的影響，因此，如使用本實驗步驟不能獲得最佳的實驗結(jié)果，可自行優(yōu)化操作細(xì)節(jié)或者篩選及配制緩沖液進(jìn)行實驗，推薦使用李記生物的相關(guān)產(chǎn)品，參照相關(guān)產(chǎn)品推薦。

4.瓊脂糖使用前應(yīng)充分振蕩均勻。瓊脂糖應(yīng)保存在儲存溶液中，防止干燥。

附錄：蛋白A/G與不同種類的Ig，s及其亞類的結(jié)合強(qiáng)度

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