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Protein A/G磁珠通常用于將抗體與血清、細胞培養(yǎng)上清或腹水分離，以及利用免疫沉淀和共同免疫沉淀從細胞或組織提取物中分離抗原的蛋白質(zhì)。Protein A/G 磁性珠含有重組蛋白 A/G，結(jié)合了蛋白質(zhì) A 和蛋白質(zhì) G 的 IgG 結(jié)合領(lǐng)域。使其成為研究和凈化免疫球蛋白的更通用、更方便的工具。

產(chǎn)品優(yōu)勢

1.具有高效的蛋白結(jié)合能力。

2.超低非特異性吸附的性能。

3.配合磁力架操作省時、簡便、溫和。

4.產(chǎn)品穩(wěn)定性高。

訂購信息

常溫運輸。4℃保存，有效期 24 個月。

技術(shù)參數(shù)

貼壁細胞樣品

1.移去培養(yǎng)基，用 PBS 洗細胞兩次。

2.收集細胞至 1.5 mL EP 管內(nèi)，按比例加入 IP Lysis/Wash Buffer，同時加入 PMSF 等相應(yīng)的抑制劑，混勻后置于冰上靜置 5-20 min（期間混勻幾次）。

3.4 ℃, 12000-16000 g,10 min 離心收集上清液，置于冰上以備后續(xù)實驗（或置于-80 ℃長期保存）。

表 1.培養(yǎng)皿 IP Lysis/Wash Buffer 推薦使用體積

懸浮細胞樣品

1.4℃、500-1000 g、10 min，收集細胞，棄上清。

2.用 PBS 洗細胞一次，即用 PBS 將細胞團重懸，4℃、500-1000 g、10 min，收集細胞，棄上清。

3.用預(yù)冷的 IP Lysis/Wash Buffer 重懸細胞。每 50mg 細胞使用 500μL IP Lysis/Wash Buffer。同時加入 PMSF 等相應(yīng)的抑制劑，混勻后置于冰上靜置 5-20 min（期間混勻幾次）。

4.4 ℃, 12000 -16000 g,10 min 離心收集上清液，置于冰上以備后續(xù)實驗（或置于-80 ℃長期保存）。

血清樣品

一般建議建議用 IP Lysis/Wash Buffer 稀釋血清樣品至目標(biāo)蛋白終濃度為 50~150 µg/mL，置于冰上備用（或置于-20 ℃長期保存）。

免疫復(fù)合物的制備

【注】：樣品所需的量和孵育時間均依賴于每個特定的抗體-抗原體系，因而可能需要優(yōu)化才能得到最大產(chǎn)量。

以下實驗方案針對 2-10μg 親和純化的抗體，根據(jù)需要可以按比例放大。

1.在離心管中，將每個樣品的細胞裂解液與 2-10μg 免疫沉淀抗體結(jié)合。每個免疫沉淀反應(yīng)推薦的總蛋白量為 500-1500μg。

2.用 IP Lysis/Wash Buffer 將抗體以及制備好的樣品稀釋至 300-500μL。

3.在室溫下孵育 1-2 h，或 4 ℃過夜，以形成免疫復(fù)合物。

免疫沉淀

【注】：為保證磁珠均勻分布，使用前通過反復(fù)顛倒或輕微渦旋混勻瓶中磁珠。

1.將 25µL(0.25 mg)的 Protein A/G Magnetic Beads 加入 1.5 mL 離心管中。

2.向磁珠中加入 500 µL 預(yù)冷 PBS，輕柔混勻。

3.將離心管放入磁力架中收集磁珠到離心管的一邊。去除上清。

4.向離心管中加入 200-500 µL IP Lysis/Wash Buffer。顛倒離心管數(shù)次或輕微渦旋混勻 1min。用磁力架收集磁珠。去除上清。

5.將抗原樣品/抗體混合物加入裝有磁珠的離心管中，保持混勻室溫下孵育 1-2 h。

6.用磁力架收集磁珠，除去未結(jié)合的樣品，保存以備分析。

7.向離心管中加入 500 µL IP Lysis/Wash Buffer，輕柔混勻。收集磁珠，棄上清。再重復(fù)洗兩次。

8.變性洗脫：向離心管中加入 80-100 µL SDS-PAGE Sample Loading Buffer（1×），將樣品置于 100℃水浴或者金屬浴中加熱 10 min。通過磁力架分離磁珠，保留含有目的抗原的上清。

【注】：如需保持蛋白活性，也可采用以下洗脫方式。

低 pH 洗脫：向離心管中加入 100 µL Elution Buffer。保持混勻在室溫下孵育離心管 5-10 min。通過磁力分離磁珠，保留含有目的抗原的上清。每 100 µL 洗出液中加入 20 µL Neutralization Buffer 來中和低 pH。

注意事項

1.本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。

2.請勿高速離心、干燥或冷凍磁珠，這些操作會導(dǎo)致磁珠聚集而降低結(jié)合能力。

3.IP 實驗中不同類型的抗體與抗原結(jié)合的親和性是有區(qū)別的，抗體與抗原結(jié)合還會受到 IP Lysis/WashBuffer 的影響，因此，如使用本實驗步驟不能獲得最佳的實驗結(jié)果，可自行優(yōu)化操作細節(jié)或者篩選及配制緩沖液進行實驗，推薦使用李記生物的相關(guān)產(chǎn)品，參照相關(guān)產(chǎn)品推薦。

4.磁珠使用前應(yīng)充分振蕩均勻。磁珠應(yīng)保存在儲存溶液中，防止干燥。

附錄：蛋白 A/G 與不同種類的 Ig，s 及其亞類的結(jié)合強度

1XPBS（無菌）（貨號：AC08L011）

Western/IP 細胞裂解液（帶抑制劑） （貨號：AP01L076）

蛋白示蹤上樣緩沖液（5 x）（貨號： AP14L036）