激光掃描共聚焦顯微鏡是激光、電子攝像和計算機圖像處理等現(xiàn)代高科技手段滲透,并與傳統(tǒng)的光學顯微鏡結(jié)合產(chǎn)生的先進的細胞分子生物學分析儀器。
激光掃描共聚焦顯微鏡是普遍顯微鏡上的質(zhì)的飛躍,是電子顯微鏡的一個補充,現(xiàn)已廣泛用于熒光定量測量,共焦圖像分析,三維圖像重建等方面,在整個細胞生物學研究領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。
1. 定量熒光測量
可進行重復(fù)性的低光探測及活細胞熒光定量分析。利用這一功能既可對單個細胞或細胞群的溶酶體,線粒體、DNA、RNA和受體分子含量、成份及分布進行定性及定量測定,還可測定諸如膜電位和配體結(jié)合等生化反應(yīng)程度。
此外,還適用于高靈敏度快速的免疫熒光測定,這種定量可以準確監(jiān)測抗原表達,細胞結(jié)合和殺傷及定量的形態(tài)學特性,以揭示諸如腫瘤相關(guān)抗原表達的準確定位及定量信息。
2. 定量共聚焦圖像分析
借助于激光共焦系統(tǒng),可以獲得生物樣品高反差、高分辨率、高靈敏度的二維圖像??傻玫酵暾畹幕蚬潭ǖ募毎敖M織的系列及光切片,從而得到各層面的信息,三維重建后可以揭示亞細胞結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系。
能測定細胞光學切片的物理、生物化學特性的變化,如DNA含量、RNA含量、分子擴散、胞內(nèi)離子等,亦可以對這些動態(tài)變化進行準確的定性、定量、定時及定位分析。
3. 三維重組分析生物結(jié)構(gòu)
使用SFP進行三維圖像重組,SFP將各光學切片的數(shù)據(jù)組合成一個真實的三維圖像,并可從任意角度觀察,也可以借助改變照明角度來突出其特征,產(chǎn)生更生動逼真的三維效果。
4. 動態(tài)熒光測定
Ca2+、pH 及其它細胞內(nèi)離子測定,利用產(chǎn)品能迅速對樣品的點,線或二維圖像掃描,測量單次、多次單色、雙發(fā)射和三發(fā)射光比率,使用諸如Indo-1、BCECF 、Fluo-3等多種熒光探針對各種離子作定量分析。
可以直接得到大分子的擴散速率,能定量測定細胞溶液中Ca2+對腫瘤啟動因子、生長因子及各種激素等刺激的反應(yīng),以及使用雙熒光探針Fluo-3和CNARF進行Ca2+和pH的同時測定。
5. 熒光光漂白恢復(fù)(FRAP)——活細胞的動力學參數(shù)
熒光光漂白恢復(fù)技術(shù)借助高強度脈沖式激光照射細胞某一區(qū)域,從而造成該區(qū)域熒光分子的光淬滅,該區(qū)域周圍的非淬滅熒光分子將以一定速率向受照區(qū)域擴散,可通過低強度激光掃描探測此擴散速率。通過儀器可直接測量分子擴散率、恢復(fù)速度,并由此而揭示細胞結(jié)構(gòu)及相關(guān)的機制。
6. 胞間通訊研究
動物細胞中由縫隙連接介導的胞間通訊被認為在細胞增殖和分化中起非常重要的作用??捎糜跍y定相鄰植物和動物細胞之間細胞間通訊,測量由細胞縫隙連接介導的分子轉(zhuǎn)移,研究腫瘤啟動因子和生長因子對縫隙連接介導的胞間通訊的抑制作用,以及胞內(nèi)Ca2+、PH和cAMP水平對縫隙連接的調(diào)節(jié)作用。
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