*原裝HAKATA FBS，10091-148，澳洲源，細(xì)胞凋亡檢測法  

★CQ★早期凋亡細(xì)胞及活細(xì)胞的胞膜正常，DNA染料碘化丙錠(PI)拒染，但可被另外一種DNA染料Hoechst342(Ho342)染色；而壞死細(xì)胞的胞膜完整性受到破壞，細(xì)胞不需固定即可被PI染色。凋亡細(xì)胞的胞膜成分亦發(fā)生改變，在凋亡早期，原來位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸(PS)遷移至脂雙層外側(cè)。另外，細(xì)胞凋亡時核酸內(nèi)切酶被激活，首先將DNA切成50～300kb大小的DNA，然后進(jìn)一步將染色質(zhì)裂解成單個核小體和寡聚核小體，形成180～200bp的DNA片斷。而壞死細(xì)胞DNA斷裂無規(guī)律性。

★CQ★上海蒂科生物是一家專注于生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域的高新技術(shù)企業(yè)，公司主營業(yè)務(wù)：胎牛血清（HAKATA、Hylone、SERANA、NTC、Corning、BOVOGEN、PAA、SIGMA等品牌），無外泌體血清(SBI)，ELISA試劑盒（HAKATA自主品牌、進(jìn)口），細(xì)胞（400多種類通過STR鑒定），培養(yǎng)基（干粉、液體），雙抗，胰酶，sigma試劑，各種品牌進(jìn)口試劑等。公司向廣大客戶提供優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品的同時，始終將客戶服務(wù)和放在比產(chǎn)品銷售更重要的位置上，公司聘請了專業(yè)技術(shù)人員，為客戶提供專業(yè)性、個性化的技術(shù)服務(wù)。公司秉承“誠實做人，誠信做事”的理念，把的產(chǎn)品和zui貼心的的服務(wù)奉獻(xiàn)給新老客戶。

*原裝HAKATA FBS，10091-148，澳洲源，細(xì)胞凋亡檢測法

上海蒂科生物綜述了細(xì)胞凋亡的生物化學(xué)檢測三種方法。

一、Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測方法

原理：在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，細(xì)胞發(fā)生凋亡zui早期，膜磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)，這一變化早于細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)濃縮、DNA片斷化和細(xì)胞膜的通透性增加等凋亡現(xiàn)象。

AnnexinV是一種磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此AnnexinV被作為檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。

碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞由于細(xì)胞膜通透性的增加，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時期的細(xì)胞區(qū)分開來。

因此，將Annexin V與PI聯(lián)合使用時，PI 則被排除在活細(xì)胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡細(xì)胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞同時被FITC 和PI 結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽性（Annexin V+/PI+）。

檢測方法：

1.按照既定程序誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

2.按照說明書配制所需溶液。

3.常規(guī)制備單細(xì)胞懸液，用冷PBS洗兩次后，取約5×106個細(xì)胞，1500rpm離心，棄上清，將細(xì)胞懸浮在400 µl×結(jié)合溶液中。

4.將細(xì)胞懸液分成5管，每管約1×106個細(xì)胞，陰性對照管不加任何試劑，陽性對照管加2%多聚甲醛固定30分鐘，用FITC標(biāo)記Annexin V和PI雙染，余下3管，其中1管只加10 µl PI，1管只加5 µl FITC標(biāo)記Annexin V，zui后一管加10 µl PI和FITC標(biāo)記Annexin V混合，室溫孵育15分鐘。

5.每管各加400 µl 1× 結(jié)合緩沖液上機檢測。

注意事項：

A.確定細(xì)胞凋亡發(fā)生的時間，PS外翻只發(fā)生在細(xì)胞凋亡早期，建議先觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)后決定取樣檢測時間。

B.由于EDTA會絡(luò)合Ca2+離子，影響Annexin V與PS的結(jié)合，因此建議不用含EDTA的胰酶消化貼壁細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)過胰酶消化后可能導(dǎo)致胰酶對細(xì)胞的進(jìn)一步作用從而導(dǎo)致細(xì)胞的進(jìn)一步凋亡，建議在用胰蛋白酶處理前單獨收集培養(yǎng)液中懸浮的細(xì)胞，保存在2%的BSA中。

，細(xì)胞凋亡檢測法

二、磷脂酰絲氨酸單抗（PS）檢測法

原理：與Annexin V相比，PS的抗體可以直接用來檢測細(xì)胞凋亡過程中PS的外翻，而且靈敏度高，特異性強，信號持續(xù)時間久，費用更低。

，細(xì)胞凋亡檢測法

三、TUNEL法

原理：TUNEL的全稱是Terminal Deoxynucleotidyl Transferase mediated dUTP Nick-End Labeling，中文名為末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP原位切口末端標(biāo)記。

細(xì)胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個漸進(jìn)的分階段的過程，染色體DNA首先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然后大約30 ﹪的染色體DNA在Ca ²+和Mg²+依賴的核酸內(nèi)切酶作用下，在核小體單位之間被隨機切斷，形成180～200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口而產(chǎn)生的一系列DNA的3’-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3’-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測，這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）。

由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3’-OH形成，很少能夠被染色。低分子量的DNA分離后，也可使用DNA聚合酶進(jìn)行缺口翻譯（nick translation），使低分子量的DNA標(biāo)記或染色，然后分析凋亡細(xì)胞。

TUNEL或缺口翻譯法實際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對完整的單個凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確的反應(yīng)細(xì)胞凋亡zui典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞凋亡測定，并可檢測出極少量的凋亡細(xì)胞，靈敏度遠(yuǎn)比一般的組織化學(xué)和生物化學(xué)測定法要高，因而在細(xì)胞凋亡的研究中已被廣泛采用。

不足之處：

(1)壞死細(xì)胞亦有DNA裂點形成,也可呈現(xiàn)TUNEL反應(yīng)陽性，因而特異性較差。據(jù)報道，TUNEL反應(yīng)中壞死細(xì)胞的標(biāo)記量比凋亡細(xì)胞的標(biāo)記量少一個數(shù)量級。

(2)TUNEL結(jié)合免疫組化檢測時，固定過程對檢測的影響較大，切片的大小、薄厚會直接影響到固定效果，從而產(chǎn)生結(jié)果的差異。

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產(chǎn)品名稱       貨號    來源       規(guī)格

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超低IgG FBS S-FBS-SA-055 SOUTH AMERICA 500ML

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活性炭/葡聚糖處理FBS S-FBS-AU-045 AUSTRALIA 500ML

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品牌2 澳洲BOVOGEN

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新生牛血清  SNCS New Zealand 500ML

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熱滅活 FBS 10082-147 USA 500ML

熱滅活FBS   10100-147 AUSTRALIA 500ML

超低IgG FBS 16250-078 USA 500ML

透析胎牛血清 FBS 264000-044 USA 500ML

活性炭/葡聚糖FBS   12676-029 USA 500Ml

馬血清  16050-122 New Zealand  500ML

熱滅活馬血清 26050-088 New Zealand 500Ml

品牌4 美國Hylone

胎牛血清FBS Sv30087.02 SOUTH AMERICA 500ML

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胎牛血清FBS SH30071.03 USA  500ML

優(yōu)等胎牛血清FBS SH30084.03 AUSTRALIA 500ML

特級胎牛血清FBS SH30070.03 USA 500ML

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標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清FBS SH30370.03 AUSTRALIA 500ML

活性炭/葡聚糖處理 SH30068.03 USA 500ML

透析胎牛血清 SH30079.03 USA 500ML

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科研用人AB血清 100-512 100ML

*的細(xì)胞產(chǎn)品：