*BOVOGEN FBS，SFBS，澳洲源，中國(guó)區(qū)代理  

★CQ★早期凋亡細(xì)胞及活細(xì)胞的胞膜正常，DNA染料碘化丙錠(PI)拒染，但可被另外一種DNA染料Hoechst342(Ho342)染色；而壞死細(xì)胞的胞膜完整性受到破壞，細(xì)胞不需固定即可被PI染色。凋亡細(xì)胞的胞膜成分亦發(fā)生改變，在凋亡早期，原來位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸(PS)遷移至脂雙層外側(cè)。另外，細(xì)胞凋亡時(shí)核酸內(nèi)切酶被激活，首先將DNA切成50～300kb大小的DNA，然后進(jìn)一步將染色質(zhì)裂解成單個(gè)核小體和寡聚核小體，形成180～200bp的DNA片斷。而壞死細(xì)胞DNA斷裂無(wú)規(guī)律性。

★CQ★上海蒂科生物是一家專注于生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域的高新技術(shù)企業(yè)，公司主營(yíng)業(yè)務(wù)：胎牛血清（HAKATA、Hylone、SERANA、NTC、Corning、BOVOGEN、PAA、SIGMA等品牌），無(wú)外泌體血清(SBI)，ELISA試劑盒（HAKATA自主品牌、進(jìn)口），細(xì)胞（400多種類通過STR鑒定），培養(yǎng)基（干粉、液體），雙抗，胰酶，sigma試劑，各種品牌進(jìn)口試劑等。公司向廣大客戶提供優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品的同時(shí)，始終將客戶服務(wù)和放在比產(chǎn)品銷售更重要的位置上，公司聘請(qǐng)了專業(yè)技術(shù)人員，為客戶提供專業(yè)性、個(gè)性化的技術(shù)服務(wù)。公司秉承“誠(chéng)實(shí)做人，誠(chéng)信做事”的理念，把的產(chǎn)品和zui貼心的的服務(wù)奉獻(xiàn)給新老客戶。

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上海蒂科生物綜述了細(xì)胞凋亡的生物化學(xué)檢測(cè)三種方法。

一、Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法

原理：在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，細(xì)胞發(fā)生凋亡zui早期，膜磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)，這一變化早于細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)濃縮、DNA片斷化和細(xì)胞膜的通透性增加等凋亡現(xiàn)象。

AnnexinV是一種磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此AnnexinV被作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。

碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞由于細(xì)胞膜通透性的增加，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開來。

因此，將Annexin V與PI聯(lián)合使用時(shí)，PI 則被排除在活細(xì)胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡細(xì)胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞同時(shí)被FITC 和PI 結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽(yáng)性（Annexin V+/PI+）。

檢測(cè)方法：

1.按照既定程序誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

2.按照說明書配制所需溶液。

3.常規(guī)制備單細(xì)胞懸液，用冷PBS洗兩次后，取約5×106個(gè)細(xì)胞，1500rpm離心，棄上清，將細(xì)胞懸浮在400 µl×結(jié)合溶液中。

4.將細(xì)胞懸液分成5管，每管約1×106個(gè)細(xì)胞，陰性對(duì)照管不加任何試劑，陽(yáng)性對(duì)照管加2%多聚甲醛固定30分鐘，用FITC標(biāo)記Annexin V和PI雙染，余下3管，其中1管只加10 µl PI，1管只加5 µl FITC標(biāo)記Annexin V，zui后一管加10 µl PI和FITC標(biāo)記Annexin V混合，室溫孵育15分鐘。

5.每管各加400 µl 1× 結(jié)合緩沖液上機(jī)檢測(cè)。

注意事項(xiàng)：

A.確定細(xì)胞凋亡發(fā)生的時(shí)間，PS外翻只發(fā)生在細(xì)胞凋亡早期，建議先觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)后決定取樣檢測(cè)時(shí)間。

B.由于EDTA會(huì)絡(luò)合Ca2+離子，影響Annexin V與PS的結(jié)合，因此建議不用含EDTA的胰酶消化貼壁細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)過胰酶消化后可能導(dǎo)致胰酶對(duì)細(xì)胞的進(jìn)一步作用從而導(dǎo)致細(xì)胞的進(jìn)一步凋亡，建議在用胰蛋白酶處理前單獨(dú)收集培養(yǎng)液中懸浮的細(xì)胞，保存在2%的BSA中。

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二、磷脂酰絲氨酸單抗（PS）檢測(cè)法

原理：與Annexin V相比，PS的抗體可以直接用來檢測(cè)細(xì)胞凋亡過程中PS的外翻，而且靈敏度高，特異性強(qiáng)，信號(hào)持續(xù)時(shí)間久，費(fèi)用更低。

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三、TUNEL法

原理：TUNEL的全稱是Terminal Deoxynucleotidyl Transferase mediated dUTP Nick-End Labeling，中文名為末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP原位切口末端標(biāo)記。

細(xì)胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個(gè)漸進(jìn)的分階段的過程，染色體DNA首先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然后大約30 ﹪的染色體DNA在Ca ²+和Mg²+依賴的核酸內(nèi)切酶作用下，在核小體單位之間被隨機(jī)切斷，形成180～200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口而產(chǎn)生的一系列DNA的3’-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3’-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）。

由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3’-OH形成，很少能夠被染色。低分子量的DNA分離后，也可使用DNA聚合酶進(jìn)行缺口翻譯（nick translation），使低分子量的DNA標(biāo)記或染色，然后分析凋亡細(xì)胞。

TUNEL或缺口翻譯法實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確的反應(yīng)細(xì)胞凋亡zui典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞凋亡測(cè)定，并可檢測(cè)出極少量的凋亡細(xì)胞，靈敏度遠(yuǎn)比一般的組織化學(xué)和生物化學(xué)測(cè)定法要高，因而在細(xì)胞凋亡的研究中已被廣泛采用。

不足之處：

(1)壞死細(xì)胞亦有DNA裂點(diǎn)形成,也可呈現(xiàn)TUNEL反應(yīng)陽(yáng)性，因而特異性較差。據(jù)報(bào)道，TUNEL反應(yīng)中壞死細(xì)胞的標(biāo)記量比凋亡細(xì)胞的標(biāo)記量少一個(gè)數(shù)量級(jí)。

(2)TUNEL結(jié)合免疫組化檢測(cè)時(shí)，固定過程對(duì)檢測(cè)的影響較大，切片的大小、薄厚會(huì)直接影響到固定效果，從而產(chǎn)生結(jié)果的差異。

上海蒂科生物為您提供實(shí)驗(yàn)所需的優(yōu)質(zhì)胎牛血清：

品牌1 德國(guó)SERANA

產(chǎn)品名稱       貨號(hào)    來源       規(guī)格

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超低IgG FBS S-FBS-SA-055 SOUTH AMERICA 500ML

透析 FBS S-FBS-US-065 USA 500ML

活性炭/葡聚糖處理FBS S-FBS-AU-045 AUSTRALIA 500ML

正常人AB血清 S-HU-US-011 USA 100ML

品牌2 澳洲BOVOGEN

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新生牛血清  SNCS New Zealand 500ML

品牌3 美國(guó)HAKATA

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優(yōu)等胎牛血清FBS 10437-028 Mexico 500ML

優(yōu)等胎牛血清FBS 10099-141 AUSTRALIA 500ML

優(yōu)等胎牛血清FBS 10099-133 AUSTRALIA 100ML

特級(jí)胎牛血清FBS 16000-044 USA 500ML

熱滅活 FBS 10082-147 USA 500ML

熱滅活FBS   10100-147 AUSTRALIA 500ML

超低IgG FBS 16250-078 USA 500ML

透析胎牛血清 FBS 264000-044 USA 500ML

活性炭/葡聚糖FBS   12676-029 USA 500Ml

馬血清  16050-122 New Zealand  500ML

熱滅活馬血清 26050-088 New Zealand 500Ml

品牌4 美國(guó)Hylone

胎牛血清FBS Sv30087.02 SOUTH AMERICA 500ML

胎牛血清FBS SV30160.03 SOUTH AMERICA 500ML

胎牛血清FBS SH30071.03 USA  500ML

優(yōu)等胎牛血清FBS SH30084.03 AUSTRALIA 500ML

特級(jí)胎牛血清FBS SH30070.03 USA 500ML

特級(jí)胎牛血清FBS SH30070.03E USA 500ML

標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清FBS SH30370.03 AUSTRALIA 500ML

活性炭/葡聚糖處理 SH30068.03 USA 500ML

透析胎牛血清 SH30079.03 USA 500ML

品牌5 PAA

胎牛血清FBS A15-101 EU 500ML

胎牛血清FBS A15-151 EU 500ML

品牌6 以色列BI

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胎牛血清FBS 04-002-1A ES胎牛血清 500ML

品牌7 美國(guó)SIGMA

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品牌8 美國(guó)GEMINI

胎牛血清FBS 900-108 SOUTH AMERICA 500ML

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科研用人AB血清 100-512 100ML

*的細(xì)胞產(chǎn)品：