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人整合素αVβ3(ITG αⅤβ3)ELISA檢測試劑盒使用方法
閱讀:154 發(fā)布時間:2019-2-19提 供 商 | 上海谷研實業(yè)有限公司 | 資料大小 | 13.9KB |
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人(Human)整合素αVβ3(ITG αⅤβ3)ELISA檢測試劑盒使用說明書
檢測原理
試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。往預
先包被整合素αVβ3(ITG αⅤβ3)抗體的包被微孔中,依次加入標本、
標準品、HRP標記的檢測抗體,經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯
色,TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成
zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的整合素αVβ3(ITG αⅤβ3)呈正
相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值),計算樣品濃
度。
樣品收集、處理及保存方法
1. 血清:使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,操作過程中避免任何細胞
刺激,收集血液后,3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細胞迅速小心地
分離。
2. 血漿:EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。
3. 細胞上清液:3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘
取上清。
5. 保存:如果樣本收集后不及時檢測,請按一次用量分裝,凍存于
-20℃,避免反復凍融,在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
自備物品
1. 酶標儀(450nm)
2. 高精度加樣器及槍頭:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3. 37℃恒溫箱
人(Human)整合素αVβ3(ITG αⅤβ3)ELISA檢測試劑盒操作注意事項
1. 試劑盒保存在2-8℃,使用前室溫平衡20 分鐘。從冰箱取出的
濃縮洗滌液會有結晶,這屬于正常現(xiàn)象,水浴加熱使結晶*溶解
后再使用。2. 實驗中不用的板條應立即放回自封袋中,密封(低溫干燥)保存。
3. 濃度為0 的S0 號標準品即可視為陰性對照或者空白;按照說明
書操作時樣本已經(jīng)稀釋5 倍,zui終結果乘以5 才是樣本實際濃度。
4. 嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。
5. 所有液體組分使用前充分搖勻。
試劑盒組成
名稱 96孔配置 48孔配置 備注
微孔酶標板12 孔×8 條12 孔×4 條無
標準品0.3mL*6 管0.3mL*6 管無
樣本稀釋液6mL 3mL 無
檢測抗體-HRP 10mL 5mL 無
20×洗滌緩沖液25mL 15mL 按說明書進行稀釋
底物A 6mL 3mL 無
底物B 6mL 3mL 無
終止液6mL 3mL 無
封板膜2 張2 張無
說明書1 份1 份無
自封袋1 個1 個無
注:標準品(S0-S5)濃度依次為:0、4、8、16、32、64 ng/mL
試劑的準備
20×洗滌緩沖液的稀釋:蒸餾水按1:20 稀釋,即1 份的20×洗滌緩
沖液加19 份的蒸餾水。
洗板方法
1. 手工洗板:甩盡孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,靜置1min 后甩盡
孔內(nèi)液體,在吸水紙上拍干,如此洗板5 次。
2. 自動洗板機:每孔注入洗液350μL,浸泡1min,洗板5 次。
人(Human)整合素αVβ3(ITG αⅤβ3)ELISA檢測試劑盒操作步驟
1. 從室溫平衡20min 后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封
袋密封放回4℃。
2. 設置標準品孔和樣本孔,標準品孔各加不同濃度的標準品50μL;
3. 樣本孔先加待測樣本10μL,再加樣本稀釋液40μL;空白孔不
加。
4. 除空白孔外,標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶
(HRP)標記的檢測抗體100μL,用封板膜封住反應孔,37℃水浴
鍋或恒溫箱溫育60min。
5. 棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復洗板5 次(也可用洗板機洗板)。
6. 每孔加入底物A、B 各50μL,37℃避光孵育15min。
7. 每孔加入終止液50μL,15min 內(nèi),在450nm 波長處測定各孔的
OD 值。
結果判斷
繪制標準曲線:在Excel 工作表中,以標準品濃度作橫坐標,對應
OD 值作縱坐標,繪制出標準品線性回歸曲線,按曲線方程計算各樣
本濃度值。
試劑盒性能
1. 準確性:標準品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R 值,大于等于
0.9900。
2. 靈敏度:zui低檢測濃度小于1.0 ng/mL。
3. 特異性:不與其它可溶性結構類似物交叉反應。
4. 重復性:板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。
5. 貯藏:2-8℃,避光防潮保存。
6. 有效期:6 個月
免責聲明
1. 試劑盒僅供研究使用,不得用于臨床實驗或人體實驗,否則所
產(chǎn)生的一切后果,由實驗者承擔,本公司概不負責。
2. 嚴格按照說明書操作,實驗者違反說明書操作,后果由實驗者
承擔。