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          人高爾基蛋白73(GP-73)ELISA試劑盒實驗原理

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          人高爾基蛋白73(GP-73)ELISA試劑盒使用說明書

           

          本試劑僅供研究使用目的:本試劑盒用于測定人血清,血漿及相關(guān)液體樣本中人高爾基蛋白73(GP-73)的含量。

          實驗原理:

            本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中人高爾基蛋白73(GP-73)水平。用純化的人高爾基蛋白73(GP-73)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入高爾基蛋白73(GP-73),再與HRP標(biāo)記的高爾基蛋白73(GP-73)抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的高爾基蛋白73(GP-73)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中人高爾基蛋白73(GP-73)含量。

           

          試劑盒組成:

          試劑盒組成 48孔配置 96孔配置 保存

          說明書 1份 1份  

          封板膜 2片(48) 2片(96)  

          密封袋 1個 1個  

          酶標(biāo)包被板 1×48 1×96 2-8℃保存

          標(biāo)準(zhǔn)品:1800ng/L 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 2-8℃保存

          標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶 2-8℃保存

          酶標(biāo)試劑 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存

          樣品稀釋液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存

          顯色劑A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存

          顯色劑B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存

          終止液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存

          濃縮洗滌液 (20ml×20倍)×1瓶 (20ml×30倍)×1瓶 2-8℃保存

           

          樣本處理及要求:

          1. 血清:室溫血液自然凝固10-20分鐘,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應(yīng)再次離心。

          2. 血漿:應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)該再次離心。

          3. 尿液:用無菌管收集,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

          4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清:檢測分泌性的成份時,用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時,用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細(xì)胞懸液,細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融,以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。

          5. 組織標(biāo)本:切割標(biāo)本后,稱取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測,其余冷凍備用。

          6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實驗。若不能馬上進(jìn)行試驗,可將標(biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融.

          7. 不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。

          人高爾基蛋白73(GP-73)ELISA試劑盒操作步驟

          ?標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣:在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔,在*、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100μl,然后在*、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl,混勻;然后從*孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl,混勻;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉,再各取50μl分別加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul,混勻;混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl,混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl,混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。(稀釋后各孔加樣量都為50μl,濃度分別為1200ng/L,800ng/L ,400ng/L,200ng/L,100ng/L)。

          ?加樣:分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl(樣品zui終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。

          ?溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

          ?配液:將30(48T的20倍)倍濃縮洗滌液用蒸餾水30(48T的20倍)倍稀釋后備用。

          ?洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復(fù)5次,拍干。

          ?加酶:每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,空白孔除外。

          ?溫育:操作同3。

          ?洗滌:操作同5。

          ?顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15分鐘. 

          ?終止:每孔加終止液50μl,終止反應(yīng)(此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。

          ?測定:以空白空調(diào)零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

          注意事項:

          ?試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,酶標(biāo)包被板開封后如未用完,板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

          ?濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,洗滌時不影響結(jié)果。

          ?各步加樣均應(yīng)使用加樣器,并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性,以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),如標(biāo)本數(shù)量多,推薦使用排槍加樣。

          ?請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線,做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高(樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的OD值),請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)(n倍)后再測定,計算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)(×n×5)。

          ?封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。

          ?底物請避光保存。

          ?嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行,試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).

          ?所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

          ?本試劑不同批號組分不得混用。

          10. 如與英文說明書有異,以英文說明書為準(zhǔn)。

          計算:

          以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),    

          在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品的OD      

          值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度;再乘以稀釋      

          倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)      

          準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值      

          代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋      

          倍數(shù),即為樣品的實際濃度。                  

            

                                                        

           

          (此圖僅供參考)

           

           

           

          人高爾基蛋白73(GP-73)ELISA試劑盒試劑盒性能:

          1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.95以上。

          2.批內(nèi)與批間應(yīng)分別小于9%和11%

           

          檢測范圍:                                              

          50ng/L -1500ng/L

                                                  

                                      

          保存條件及有效期:

          1.試劑盒保存:;2-8℃。

          2.有效期:6個月

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