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NADH氧化酶（NADH oxidase，NOX）試劑盒說(shuō)明書
閱讀：87 發(fā)布時(shí)間：2022-10-7| 提 供 商 | 上海谷研實(shí)業(yè)有限公司 | 資料大小 | 35.5KB |
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NADH氧化酶（NADH oxidase，NOX）試劑盒說(shuō)明書
分光光度法 50管/48樣
正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
NOX（EC 1.6.99.3）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，可在氧氣存在下，直接將NADH氧化為NAD。該酶不僅參與NAD的再生，而且與免疫反應(yīng)密切相關(guān)。
測(cè)定原理：
NOX能夠?qū)ADH氧化為NAD，NADH的氧化與2,6二氯酚靛藍(lán)（DCPIP）的還原相偶聯(lián)，藍(lán)色的DCPIP被還原為無(wú)色的DCPIP，在600nm下測(cè)定藍(lán)色DCPIP的還原速率計(jì)算出NADH氧化酶活性的大小。
需自備的儀器和用品：
可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰、蒸餾水
試劑的組成和配制：
試劑一：液體50mL×1瓶，-20℃保存。
試劑二：液體10mL×1瓶，-20℃保存。
試劑三：液體1mL×1瓶，-20℃保存。
試劑四：液體50mL×1瓶，4℃保存。
試劑五：液體6 mL×1瓶，4℃保存。
試劑六：粉劑×2瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入5mL蒸餾水；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
樣本的前處理：
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
①準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
②將勻漿600g，4℃離心5min。
③棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。
④上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的NOX（此步可選做）。
⑤步驟④中的沉淀即為線粒體，加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10秒，重復(fù)30次），用于NOX活性測(cè)定。
血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。
測(cè)定步驟：
1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至600nm，蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測(cè)定
（1）試劑四、試劑五和試劑六于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）孵育5min。
（2）在1mL石英比色皿中加入40μL樣本、700μL試劑四、100μL試劑五和160μL試劑六，混勻，記錄600nm處20s時(shí)吸光值A(chǔ)1和 1min20s后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A1-A2。
NOX活力單位的計(jì)算
1、血清（漿）NOX活力的計(jì)算:
單位的定義：每mL血清（漿）在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個(gè)酶活力單位。
NOX（U/mL）＝ΔA×V反總÷V樣÷0.01÷T=2500×ΔA
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NOX活力的計(jì)算:
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個(gè)酶活力單位。
NOX（U/mg prot）=ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.01÷T=2500×ΔA÷Cpr
此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2）按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每g組織在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個(gè)酶活力單位。
NOX（U/g 鮮重）=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.01÷T=505×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個(gè)酶活力單位。
NOX（U/104 cell）=ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.01÷T=1.01×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，1mL； V樣：加入樣本體積，0.04mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)。