恙蟲病東方體探針法熒光定量PCR試劑盒所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

實(shí)驗(yàn)過程：
一、恙蟲病東方體探針法熒光定量PCR試劑盒試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．產(chǎn)品僅用于科研對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
      10×PCR buffer             5μl
      dNTP mixl                 4μl
      引物1（10pM）               2μl
      引物2（10PM）              2μl
      Taq酶（2U/μl）            1μl
      DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
     加ddH2O至               50 μl
     視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
參數(shù)規(guī)格：
產(chǎn)品名稱：恙蟲病東方體探針法熒光定量PCR試劑盒
英文名稱：Orientia tsutsugamushi
產(chǎn)品規(guī)格：50T
產(chǎn)品運(yùn)輸：低溫運(yùn)輸
產(chǎn)品保存：-20℃保存
產(chǎn)品有效期：一年
產(chǎn)品特點(diǎn)：本產(chǎn)品就是根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)引物而開發(fā)的高靈敏熒光定量 PCR 產(chǎn)品。
運(yùn)輸及保存
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限一年。
自備試劑
DNA模板、10×ROX（根據(jù)機(jī)型決定，具體見使用方法）。
本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。

?
產(chǎn)品及特點(diǎn)：
1. 即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。
2. 根據(jù)鮑皰疹樣病毒探針法熒光定量保守序列設(shè)計(jì)的專一性引物，與相關(guān)病毒無交叉反應(yīng)。
3. 靈敏度可以達(dá)到幾百拷貝/反應(yīng)。
4. 一管式熒光定量PCR檢測(cè)，避免后續(xù)污染。
5. 本試劑盒足夠50次20μL反應(yīng)體系的熒光定量PCR。
以下是公司正在熱銷的產(chǎn)品：
PicrosideⅡ幽門螺旋桿IgM檢測(cè)試劑盒20mg

 白血病抑制因子受體(LIFR)重組蛋白英文名稱：Recombinant Leukemia Inhibitory Factor Receptor (LIFR)

降鈣素(CT)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 EDEM2 / C20orf31 蛋白 (His 標(biāo)簽)*1000(g)

ADAMTS4(Human ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif4) ELISA Kit  人ADAM金屬肽酶含血小板反應(yīng)蛋白1基元4CAS號(hào)：308445 碳酐酶檢測(cè)試盒5gHuman/人Elisa試盒3083101

PicrosideⅠ幽門螺旋IgG檢測(cè)試劑盒20mg

化木蘭花堿 質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥98%，標(biāo)準(zhǔn)品 Magnoflorine iodide

降鈣素(CT)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 DCUN1D1 / SCCRO 蛋白 (His 標(biāo)簽)*250

Human similar to RIKEN cDNA 4933429F08 gene ELISA Kit  人類似RIKEN cDNA 4933429F08 基CAS號(hào)：149 碳酐酶6檢測(cè)試盒1gHuman/人Elisa試盒3084400

化5mg

β-蛻皮激素 對(duì)照品 訂購|咨詢 規(guī)格： 50mg 多巴受體D5抗體 TUBδ ELISA Kit 微管蛋白δ(TUBδ)ELISA試劑盒

bovine Insulin protein   牛胰島素蛋白*L乳脫氫酶A鏈檢測(cè)試盒100gHuman/人Elisa試盒492386

DAPI染色液5mg

落干;Loganic acid 規(guī)格： 20mg 訂購|咨詢 Psi2 DAP(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)5×106cells/瓶×2

Tachyplesin I(Tachyplesin1 precursor )  抗菌肽進(jìn)口、分裝M2型激酶檢測(cè)試盒1gHuman/人Elisa試盒4923879

DAPI染色液5mg

檸檬 訂購|咨詢 規(guī)格： 200mg 周期素D2抗體 MYO/MB ELISA Kit 肌紅蛋白(MYO/MB)ELISA試劑盒

TRH (Thyrotropin releasing hormone )  促狀腺素釋放激素進(jìn)口、原裝連蛋白檢測(cè)試盒25gHuman/人Elisa試盒4923879
恙蟲病東方體探針法熒光定量PCR試劑盒苦龍膽苷 CAS號(hào)： 21018848 規(guī)格： HPLC≥98%;10mg 訂購|咨詢

康普瑞汀二 CAS號(hào)： 168555666 規(guī)格： HPLC≥98%;20mg 訂購|咨詢

康普瑞汀 CAS號(hào)： 117048596 規(guī)格： HPLC≥98%;20mg 訂購|咨詢

卡枯 CAS號(hào)： 18607904 規(guī)格： HPLC≥98%;20mg 訂購|咨詢

柯伊利素7O葡萄糖苷 CAS號(hào)： 19993329 規(guī)格： HPLC≥98%;20mg 訂購|咨詢

柯諾辛B CAS號(hào)：  規(guī)格： HPLC≥98%;20mg 訂購|咨詢

柯諾辛 CAS號(hào)： 6877323 規(guī)格： HPLC≥98%;20mg 訂購|咨詢

奎寧 CAS號(hào)： 130950 規(guī)格： HPLC≥98%;20mg 訂購|咨詢

苦馬豆素 CAS號(hào)： 72741878 規(guī)格： HPLC≥98%;1mg 訂購|咨詢

開環(huán)異落葉松樹脂 CAS號(hào)： 29388598 規(guī)格： HPLC≥98%;20mg 訂購|咨詢

卡比多巴 CAS號(hào)： 28860959 規(guī)格： HPLC≥98%;20mg 訂購|咨詢

咖 CAS號(hào)： 102374 規(guī)格： HPLC≥98%;20mg 訂購|咨詢

杠柳毒苷 CAS號(hào)： 13137649 規(guī)格： HPLC≥98%;20mg 訂購|咨詢

假荊芥屬苷 CAS號(hào)： 569904 規(guī)格： HPLC≥98%;20mg 訂購|咨詢

京尼平龍膽雙糖苷 CAS號(hào)： 29307606 規(guī)格： HPLC≥98%;20mg 訂購|咨詢
使用方法：
一、稀釋PCR陽性對(duì)照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例）
1. 注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供可以直接使用的DN段作為陽性對(duì)照。
2. 標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為7，6，5，4，3，2。
3. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
4. 在7號(hào)管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對(duì)照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。
5. 換槍頭，在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。
6. 換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對(duì)照到5號(hào)管中，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。
7. 重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
8. 如果有N個(gè)樣品，必須設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽性對(duì)照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）。可以用10μL上步制備的PCR陽性對(duì)照的第4號(hào)（濃度為1×10E4 拷貝/μL，10μL相當(dāng)于1萬拷貝）或第5號(hào)（濃度為1×10E5 拷貝/μL，10μL相當(dāng)于10萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。
9. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。
三、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20 μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）
10. 如果只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照，6個(gè)用于PCR陽性對(duì)照。如果做2-3次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。
11. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好。