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果蠅的神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)與哺乳動(dòng)物系統(tǒng)非常相似，它們有許多類似的大腦結(jié)構(gòu)，涉及類似的行為，并且許多已知影響哺乳動(dòng)物行為的基因在果蠅中存在并執(zhí)行相同的功能。強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)（FST）已被廣泛用于評(píng)估化合物的抗抑郁功效，果蠅也嘗試采用這種試驗(yàn)。蠅類強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)有可能成為評(píng)估潛在抗抑郁藥物的一種經(jīng)濟(jì)高效、高通量的檢測方法。


強(qiáng)迫游泳測試（FST）是一種行為絕望范式，經(jīng)常用于大鼠，以測量應(yīng)對(duì)不可避免的逆境應(yīng)對(duì)策略，其中被動(dòng)應(yīng)對(duì)策略（不動(dòng)）被解釋為抑郁樣，而減少不動(dòng)則作為抗抑郁藥樣的證據(jù) 效果。FST可用于篩選給予其他健康大鼠藥物的抗抑郁作用，用于抑郁癥動(dòng)物模型中的被動(dòng)應(yīng)對(duì)策略，或用于研究抑郁癥的動(dòng)物給予藥物的抗抑郁樣作用。

在這項(xiàng)研究中，我們使用與抗抑郁癥有關(guān)的methamphetamine（METH）、DL-α-methyltyrosine（αMT）、citalopram（CIT）以及psilocybin（PSI）、5-HT1A受體拮抗劑 WAY 100635（WAY）和5-HT2受體拮抗劑 Ketanserin（KET），對(duì)果蠅運(yùn)動(dòng)活動(dòng)以及FST的影響進(jìn)行了藥理評(píng)估。

方法
果蠅活動(dòng)監(jiān)測系統(tǒng)用于測量隨時(shí)間變化的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)。將雌雄蒼蠅分別放入透明的試管中，試管的一端塞有松散的棉花團(tuán)，另一端裝有食物培養(yǎng)基和塑料蓋。食物培養(yǎng)基為vehicle、METH（5.0 mM）、αMT（3.0 mM）、CIT（0.3、1.0 或 2.5 mM）、PSI（0.03 mM、3.5 mM）、KET（1.0 mM）或 WAY（1.0 mM）。1×表示在分組條件下用處理食物喂養(yǎng)蒼蠅24小時(shí)，之后轉(zhuǎn)移到vehicle培養(yǎng)基的試管中，用vehicle培養(yǎng)基中的PSI（0.03 mM）喂養(yǎng)蒼蠅 1 天，然后用vehicle培養(yǎng)基喂養(yǎng)蒼蠅 4 天。5×表示蒼蠅在上述試管中連續(xù)喂食處理食物5天。將蒼蠅放入活動(dòng)監(jiān)測系統(tǒng)，每個(gè)處理組的雌雄蠅各為n= 16，并在恒定光照條件下飼養(yǎng)至少 5 天，同時(shí)進(jìn)行監(jiān)測。所有其他蒼蠅均在恒定光照條件下飼養(yǎng) 5 天，然后在 FST 中進(jìn)行測試，每個(gè)處理組中雌雄各n= 7 只，FST 中的單個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表 16 只蒼蠅的平均行為。如圖 1所示。

圖1

果蠅強(qiáng)迫游泳測試(FST)用于測量兩種實(shí)驗(yàn)室6天齡雄性和雌性的不動(dòng)行為。將一天齡（5×）或兩天齡（1×）的未被誘導(dǎo)的蒼蠅進(jìn)行短暫麻醉，并分別放入塑料管中。然后將這些試管棉花狀放入200 mL移液器吸頭盒的支架中，并在恒定光照下放置至第5天。在4孔室載玻片上每孔放置一只果蠅，對(duì)蒼蠅的FST行為進(jìn)行評(píng)估。使用頂置攝像頭記錄蒼蠅在孔中最初5分鐘的FST行為，以便隨后使用動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡跟蹤系統(tǒng)分析SC不動(dòng)的潛伏期、不動(dòng)的時(shí)間和不動(dòng)的次數(shù)。為了驗(yàn)證蒼蠅是否具有活動(dòng)能力，在錄制5分鐘視頻后，用工具將每只蒼蠅輕輕取出并放到紙巾上。任何不能立即離開的蒼蠅都被認(rèn)為是淹死的，隨后被排除在最終分析之外。由于CS果蠅的不同亞品系已顯示出運(yùn)動(dòng)活動(dòng)差異，因此在強(qiáng)迫游泳測試中比較了兩種 CS 亞品系（CSX和CSCLWU）。


結(jié)果
強(qiáng)迫游泳行為和整體運(yùn)動(dòng)活動(dòng)因性別、劑量和給藥策略而異
在果蠅活動(dòng)監(jiān)測中分析發(fā)現(xiàn)，性別和治療之間存在顯著的相互作用，以及性別引起的顯著變化和治療。飼喂vehicle培養(yǎng)基的CSX雌性和雄性比同性CSCLWU顯著更活躍（圖2A）。CSX和CSCLWU雄性的活躍程度顯著低于同品系雌性。PSI (0.03 mM) 增加了 CSX 雌性果蠅的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)，但不增加CSX雄性或 CSCLWU 果蠅的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)。

在FST中，對(duì)自變量性別（雄性、雌性）和品系（CSX、CSCLWU）進(jìn)行雙向方差分析發(fā)現(xiàn)，性別和品系之間存在顯著的交互作用，以及性別引起的顯著變化和應(yīng)變。雄性比雌性和CSX雄性更加不動(dòng)，但雄性和雌性CSX果蠅之間沒有觀察到差異（圖2B）。CSX 雌性和雄性的不動(dòng)次數(shù)明顯少于同性 CSCLWU（圖 2B）。

由于給予 0.03 PSI (1×) 的CSCLWU果蠅在FST中更加不動(dòng)，并且沒有增加它們在果蠅活動(dòng)監(jiān)測系統(tǒng)中的整體運(yùn)動(dòng)活性，因此選擇該品系進(jìn)行額外的實(shí)驗(yàn)。此外，由于雄性CSCLWU果蠅明顯比雌性果蠅更不動(dòng)，因此在隨后的FST分析中對(duì)性別進(jìn)行了獨(dú)立評(píng)估。

圖2

強(qiáng)迫游泳中的靜止?fàn)顟B(tài)與整體運(yùn)動(dòng)活動(dòng)無關(guān)，CIT可以減少這種不動(dòng)性
將FST行為與第五天在用vehicle或vehicle介質(zhì)中的藥物喂養(yǎng)的果蠅活動(dòng)監(jiān)測系統(tǒng)中的整體運(yùn)動(dòng)活動(dòng)進(jìn)行比較（圖 1）。使用的藥物為 METH (5.0 mM)、αMT (3.0 mM) 和 CIT (0.3 mM、1.0 mM、2.5 mM)。

對(duì)自變量性別（雄性、雌性）和藥物治療（vehicle、METH）的雙向方差分析發(fā)現(xiàn)，性別和治療之間存在顯著的交互作用，以及由性別和治療引起的顯著變異。飼喂vehicle的雄性活性顯著低于飼喂vehicle的雌性。METH顯著增加了雄性和雌性的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)（圖 3A）。

自變量性別（雄性、雌性）和藥物治療（vehicle，αMT）的雙向方差分析發(fā)現(xiàn)性別和治療之間存在顯著的相互作用，以及性別和治療之間的顯著變化。飼喂vehicle的雄性的活性顯著低于飼喂vehicle的雌性。αMT顯著降低雄性和雌性的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)（圖 3B）。

對(duì)自變量性別（雄性、雌性）和藥物治療（vehicle、0.3、1.0和2.5 mM CIT）的雙向方差分析發(fā)現(xiàn)性別和治療之間存在顯著的相互作用，以及兩種性別引入的顯著變異和治療。飼喂vehicle的雄性活性顯著低于飼喂vehicle的雌性。2.5 mM CIT 顯著降低雌性的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)，但各組之間沒有觀察到其他差異。（圖 3C）。

由于雄性在果蠅活動(dòng)監(jiān)測系統(tǒng)時(shí)活躍程度始終顯著較低（圖 2a、3a-c），因此使用單向方差分析獨(dú)立評(píng)估性別的FST行為。CIT顯著降低了雄性的不動(dòng)性，增加了雌性和雄性的SC不動(dòng)潛伏期，并減少了雄性的不動(dòng)次數(shù)。與vehicle相比，METH或αMT的任何結(jié)果測量均未觀察到顯著差異（圖 4）。

圖3

圖4

對(duì)PSI的總體運(yùn)動(dòng)反應(yīng)因性別、劑量和用藥策略而異
為了評(píng)估PSI對(duì)果蠅活動(dòng)監(jiān)測系統(tǒng)中整體運(yùn)動(dòng)活動(dòng)的影響，給予PSI (0.03 mM、3.5 mM) (1x)。自變量性別（雄性、雌性）和藥物治療（vehicle，PSI 3.5 mM，PSI 0.03 mM）的雙向方差分析發(fā)現(xiàn)性別和治療之間存在顯著的相互作用（圖5A），并且因性別和治療造成顯著差異。對(duì)照雄性的活躍程度顯著低于雌性。PSI在3.5 mM時(shí)降低雌性的運(yùn)動(dòng)活性，但在3.5 mM和0.003 mM時(shí)增加雄性的運(yùn)動(dòng)活性。

慢性和低劑量PSI對(duì)整體運(yùn)動(dòng)活動(dòng)的影響不同
為了評(píng)估PSI在果蠅運(yùn)動(dòng)監(jiān)測中的結(jié)果是否是由于5-HT1A或5-HT2A血清素受體的作用所致，在PSI（0.03mM）、WAY（1.0mM）、KET（1.0mm）及vehicle上飼養(yǎng)蒼蠅5天（5×）。分析發(fā)現(xiàn)性別和藥物治療之間存在顯著的相互作用，以及由于性別和藥物治療而產(chǎn)生的顯著變化（圖5B）。對(duì)照組雄性的活躍程度顯著低于雌性。KET顯著降低雌性和雄性的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)。WAY 顯著降低了雄性的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)，但對(duì)雌性沒有影響。接受PSI的雌性和雄性明顯比接受 KET的同性更活躍。（圖 5B）。

圖5

PSI對(duì)強(qiáng)迫游泳中不動(dòng)的影響與CIT相當(dāng)
CIT 5× 能顯著降低雄性的不動(dòng)性、SC不動(dòng)性潛伏期和陣發(fā)性不動(dòng)性，并能顯著降低雌性的SC不動(dòng)性潛伏期和陣發(fā)性不動(dòng)性。在 3.5 mM和 0.03 mM下，PSI能明顯降低雄性的不動(dòng)性；在 3.5 mM和 0.03 mM下，PSI能明顯降低雄性第一次不動(dòng)的潛伏期；在 3.5 mM和 0.03 mM濃度下，PSI能明顯降低雄性不動(dòng)的陣發(fā)性。（圖6）。

圖6

討論
METH（圖3A）和αMT（圖3A）顯著改變雄性和雌性果蠅的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)，但很大程度上不影響FST行為（圖4）。相比之下，CIT (1.0 mM) 5×?不影響雄性或雌性果蠅的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)（圖 3C），但顯著降低雄性不動(dòng)性、兩性的不動(dòng)潛伏期和雄性不動(dòng)性發(fā)作次數(shù)（圖 4）。因此，FST的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)與整體運(yùn)動(dòng)活動(dòng)脫鉤，并受到 SSRI 抗抑郁藥物的選擇性調(diào)節(jié)（圖 4）。

高劑量和低劑量的PSI 1×?均顯著降低了FST中雄性的不動(dòng)行為（圖 6），但也增加了果蠅活動(dòng)監(jiān)測中的整體運(yùn)動(dòng)活動(dòng)。在FST的典型使用中，抗抑郁藥物選擇性地增加FST的活性，但不會(huì)增加整體運(yùn)動(dòng)活性。然而，在FST的典型使用中，所研究的藥物是在測試后24小時(shí)內(nèi)服用的。在此實(shí)驗(yàn)中，僅施用PSI一天，然后在測試前對(duì)果蠅施用vehicle 4天。與雌性和另一品系的雄性相比，CSCLWU雄性果蠅似乎特別不愛動(dòng)（圖2），因此 DAMS 和 FST 中運(yùn)動(dòng)活動(dòng)的增加可能表明功能的增強(qiáng)和隨后行為的正?；?。支持這一假設(shè)的是，PSI（0.03 mM）5×以及 WAY 和 KET 5×降低了雄性 DAMS 的活動(dòng)（圖5B）。 WAY 對(duì) 5-HT1A 受體的慢性拮抗作用和KET對(duì) 5-HT2 受體的慢性拮抗作用導(dǎo)致了與慢性PSI相似的行為結(jié)果。因此，觀察到的果蠅活動(dòng)監(jiān)測中活性降低可能是受體內(nèi)化的結(jié)果。

參考文獻(xiàn)
Hibicke M, Nichols C D. Validation of the forced swim test in Drosophila, and its use to demonstrate psilocybin has long-lasting antidepressant-like effects in flies[J]. Scientific Reports, 2022, 12(1): 10019.

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