96 孔板微生物學(xué)法微量測(cè)定葉酸是葉酸測(cè)定方法的重大改進(jìn), 這使測(cè)定時(shí)間大為縮短。原來(lái)試管法需時(shí) 36～48h，現(xiàn)縮短為 16～18h，而且這一方法更為、靈敏、簡(jiǎn)便。 96孔板葉酸測(cè)定使用量更微，測(cè)試樣本量大、重復(fù)性好，適用于大批量樣本的檢測(cè)研究。下面介紹一種96孔板法測(cè)定血液中葉酸含量的操作方法[1]。
葉酸生長(zhǎng)培養(yǎng)基
取4.7 g葉酸培養(yǎng)基加入到 100 mL蒸餾水中煮沸，冷卻后加入氯霉素 0.05 g、抗壞血酸0.75 g，每20 mL分裝于培養(yǎng)管中，保存于－80℃ 。
菌株
將 1 支凍干乳酸桿菌氯霉素耐藥株接種于20 mL葉酸生長(zhǎng)培養(yǎng)基充分搖勻后，置于 37℃ 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，取1 mL 接種于另一個(gè)20 mL 新鮮生長(zhǎng)培基傳代培養(yǎng)，得到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液，與 80% 的甘油等體積混合，每1 mL 分裝保存于 -80℃。
檢測(cè)培養(yǎng)基
稱取9.4g Himedia葉酸測(cè)定用培養(yǎng)基（貨號(hào)：M543）干粉培養(yǎng)基溶于100mL蒸餾水，加入50mg抗壞血酸。加熱至沸騰使培養(yǎng)基*溶解。測(cè)定時(shí)，分裝至每管為5mL培養(yǎng)基（包含標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品）。加蒸餾水，使總體積達(dá)到10mL。高壓消毒15磅121°C 5分鐘。立即冷卻，臨用前加入氯霉素 0.03 g，抗壞血酸 0.75 g和 200μL 菌株。
標(biāo)準(zhǔn)曲線
取 100 μg / L 的葉酸標(biāo)準(zhǔn)液用0.5% 抗壞血酸鈉溶液 1∶200 稀釋，得到 0.5 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作液。在 96孔酶標(biāo)板中1～12列分別加入標(biāo)準(zhǔn)工作溶液 0 μL、0 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、30 μL、40 μL、50 μL、60 μL、80 μL、100 μL，用0.5% 抗壞血酸鈉溶液定容至 100 μL，列加入10 μL 的疊氮鈉溶液( 3% ) 作為空白對(duì)照。全板每孔加 150 μL Himedia葉酸測(cè)定用培養(yǎng)基，封膜，37℃厭氧培養(yǎng)42 h，采用免疫酶聯(lián)測(cè)定儀測(cè)定595 nm下吸光度(A)值。以葉酸濃度為自變量(X)濃度為(0、0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5)μg/L
，以乳酸桿菌生長(zhǎng)后培養(yǎng)基 A 值為因變量(Y) 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
( 5 )測(cè)定
將血漿標(biāo)本用 0.5% 抗壞血酸鈉溶液40 倍稀釋，分別在 A1，A2，A3 孔加100 μL，在 B1，B2，B3 孔加 50 μL。B 行用 0.5% 抗壞血酸鈉溶液定容至 100 μL。A1，A2，B1，B2作為測(cè)定孔，A3，B3 孔加 10 μL疊氮鈉溶液( 3% ) 作為空白對(duì)照孔。每孔分別加入 150 μL Himedia葉酸測(cè)定用培養(yǎng)基，培養(yǎng)方法同上。測(cè)各樣本生長(zhǎng)后的吸光度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算樣品中葉酸含量。
參考文獻(xiàn)
[1] 徐文婕，曲全岡，劉建蒙.微生物法檢測(cè)血漿葉酸實(shí)驗(yàn)方法評(píng)價(jià)及應(yīng)用. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志[J] 2011 , 7 (21 ): 1722-1724.
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