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背景：

外泌體是細(xì)胞分泌的一類具有細(xì)胞間通訊作用的細(xì)胞外囊泡，已被證明外泌體中包含了大量的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物活性物質(zhì)。其中的微小RNA (microRNA，miRNA) 是外泌體中比較具代表性的，也是目前研究最多的核酸。miRNA是18-25個核苷酸的非編碼小RNA分子，它可以通過與靶mRNA的3’非翻譯區(qū)或開放閱讀框區(qū)域結(jié)合而介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默，在細(xì)胞增殖、分化、遷移及疾病發(fā)生和發(fā)展等過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

miRNA的生成：

miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉(zhuǎn)錄生成長度約為幾千個堿基的初級miRNA (pri-miRNA) 。pri-miRNA在蛋白復(fù)合物Drosha-DGCR8的作用下被加工成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體miRNA (pre-miRNA) ，pre-miRNA在轉(zhuǎn)運蛋白的協(xié)助下從核內(nèi)轉(zhuǎn)運到細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miRNA被Dicer-TRBP識別，并通過對莖環(huán)結(jié)構(gòu)的剪切和修飾，形成雙鏈成熟的miRNA，但其中一條鏈迅速降解，另一條鏈被轉(zhuǎn)載進(jìn)AGO2蛋白中，形成RISC（RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體），最終生成成熟的、具有功能單鏈miRNA。

單鏈miRNA與靶miRNA轉(zhuǎn)錄物相互作用，從而導(dǎo)致基因表達(dá)的抑制。

圖 外泌體miRNA分泌機制

miRNA的特性：

1、高度保守性：miRNA保守性具有重要的生物學(xué)意義，提示在不同生物發(fā)育過程中，miRNAs具有相同的調(diào)控機制；

2、組織表達(dá)特異性：一些miRNA表達(dá)具有細(xì)胞和組織特異性；

3、時序表達(dá)特異性性：在不同組織、不同發(fā)育階段，miRNA的表達(dá)水平有顯著差異，miRNA表達(dá)是動態(tài)調(diào)控的。

miRNA的功能：

目前只有一小部分miRNAs生物學(xué)功能得到闡明。但這些miRNAs調(diào)節(jié)了細(xì)胞生長，組織分化，因而與生命過程中發(fā)育、疾病有關(guān)。通過對基因組上miRNA的位點分析，顯示其在發(fā)育和疾病中起了非常重要的作用。一系列的研究表明：miRNAs在細(xì)胞生長和凋亡，血細(xì)胞分化，神經(jīng)元的極性，胰島素分泌，大腦形態(tài)形成，心臟發(fā)生，胚胎后期發(fā)育等過程中發(fā)揮重要作用。對于新的miRNA基因的分析，可能發(fā)現(xiàn)新的參與器官形成、胚胎發(fā)育和生長的調(diào)節(jié)因子，促進(jìn)對癌癥等人類疾病發(fā)病機制的理解。

miRNA檢測方法：

考慮到miRNAs在基因調(diào)控和生物學(xué)功能中起到的關(guān)鍵作用，對miRNAs的特異性和敏感性檢測變得越來越重要。傳統(tǒng)的針對miRNA的檢測有Northern blotting、微陣列分析和定量聚合酶鏈反應(yīng) (qPCR) 。

1、Northern blotting

Northern blotting是檢測miRNA的標(biāo)準(zhǔn)和比較廣泛使用的方法。它不僅可以用于成熟miRNA的檢測，還可以用于其前體的檢測。其基本原理是將RNA樣品用限制性內(nèi)切酶酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離，根據(jù)其在凝膠中的位置變性并轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜或尼龍膜上，固定后與同位素或其他標(biāo)記探針反應(yīng)。洗凈游離探針后，可以通過放射自顯影或其他合適的技術(shù)檢測miRNA。Northern blotting可以檢測到miRNA的相對分子大小和相對豐度，但也存在半定量、低通量、繁瑣、耗時、RNA易降解等缺點。

2、微陣列分析

微陣列分析是快速、高通量檢測miRNA比較廣泛使用的方法。該方法原理是使用標(biāo)記探針通過反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生樣品RNA，使用與目標(biāo)miRNA具有相同序列的固相寡核苷酸檢測這些熒光團或生物素標(biāo)記的cDNA。將標(biāo)記的cDNA樣品裝入每個孔中，然后進(jìn)行一系列洗滌步驟以去除游離DNA。如果雜交的cDNA被生物素化，鏈霉親和素標(biāo)記的熒光團就可以被標(biāo)記;如果用熒光團標(biāo)記cDNA，則可以直接測量每個孔的熒光強度。每個孔的熒光強度可以用來確定miRNA的表達(dá)水平。雖然微列陣芯片針對的樣本數(shù)量很多，但是成本也非常高。另外太短、低拷貝數(shù)的miRNA無法被檢測到。

3、qPCR

qPCR因其動態(tài)范圍大、靈敏度高、序列特異性高，已成為檢測miRNA表達(dá)的常規(guī)可靠技術(shù)。首先通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將目標(biāo)miRNA合成為cDNA，然后進(jìn)行qPCR檢測。要進(jìn)行miRNA逆轉(zhuǎn)錄，需要對miRNA分子進(jìn)行加長改造，一種方法采取的是進(jìn)行Poly (A) 加尾，另一種采取的莖環(huán)法進(jìn)行加長。監(jiān)測miRNA的qPCR方法有兩種：TaqMan探針法和SYBR Green熒光染料法。

miRNA定量全套實驗步驟：

圖 miRNA qPCR解決方案

從各類樣本中提取miRNA，根據(jù)miRNA數(shù)量選擇不同逆轉(zhuǎn)錄方法合成cDNA（如何選擇miRNA逆轉(zhuǎn)錄方法見），最后進(jìn)行miRNA定量。我們推薦從miRNA提取到逆轉(zhuǎn)錄、定量需要要配套的試劑盒。

一、miRNA提取

* 以血清血漿樣本為例進(jìn)行介紹（血漿血清miRNA提取試劑盒，abs60264）

1、實驗前處理；

1.1 實驗前自行準(zhǔn)備：無水乙醇、1.5mL RNase-free滅菌離心管。
1.2 取出洗滌液，按以下操作：
a）洗滌液A：按終濃度30%的比例加入無水乙醇，如7mL加入3mL無水乙醇；14mL加入6mL無水乙醇，充分混勻。
b）洗滌液B：按終濃度85%的比例加入無水乙醇，如1.5mL加入8.5mL無水乙醇；3mL加入17mL無水乙醇，充分混勻。
* 配制好的洗滌液如出現(xiàn)沉淀，可在37℃溶解，搖勻后使用。

2、取無RNA酶的1.5mL離心管，加入200μL樣本，200μL miRNA釋放劑及20μL消化液，充分混勻，65℃水浴10min；
3、加入5μL miRNA富集劑，0.85mL無水乙醇，輕輕顛倒混勻，如有半透明懸浮物，不影響RNA的提取與后續(xù)實驗；
4、將吸附柱放入收集管內(nèi)，將650μL上述溶液轉(zhuǎn)入吸附柱內(nèi)，12000rpm離心1min，棄收集管內(nèi)廢液；將剩余溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱內(nèi)，12000rpm離心1min，棄收集管內(nèi)廢液；
5、將吸附柱放回收集管內(nèi)，加500μL洗滌液A至吸附柱內(nèi)，靜置2min，12000rpm離心1min，棄收集管內(nèi)廢液；
6、將吸附柱放回收集管內(nèi)，加500μL洗滌液B至吸附柱內(nèi)，靜置2min，12000rpm離心1min，棄收集管內(nèi)廢液；
7、將吸附柱放回收集管內(nèi)，加500μL洗滌液B至吸附柱內(nèi)，12000rpm離心1min，棄收集管內(nèi)廢液；
8、按每份樣本30μL取洗脫液（如10份提取樣本，即取300μL洗脫液），放置于滅菌1.5mL離心管，65℃預(yù)熱；
9、將吸附柱放回收集管內(nèi)，12000rpm離心2min，離去殘留的洗滌液；
10、取出吸附柱，放入新的1.5mL RNase-free滅菌離心管內(nèi)，開蓋，室溫放置2min；
11、在吸附柱中心加入30μL預(yù)熱洗脫液，靜置2min，12000rpm離心1min，收集miRNA溶液。提取的miRNA即可用于下一步實驗或-70℃保存。

二、miRNA逆轉(zhuǎn)錄

* 以加尾法為例進(jìn)行實驗步驟介紹，血漿miRNA加尾法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（abs60266）

1、RNA加A尾

 取RNase-free離心管，配制如下混合液：RNase free ddH₂O to 20μL 、Poly A 1μL、2xPoly A Buffer 10μL、RNA 5~9μL輕輕混勻，37℃ 30min，迅速置于冰上。

2、RT反應(yīng)液配制：

上述反應(yīng)液在使用前5000rpm離心5s：取上述反應(yīng)液8μL、2x RT Buffer 10μL、 RTase Mix 2μL用移液器輕輕吹打混勻。

3、RT反應(yīng)：

25℃ 5min、50℃ 15min、85℃ 5min反應(yīng)完畢后，5000rpm離心5s，盡快放于冰上，直接進(jìn)行PCR反應(yīng)。如暫時不用，請放置于-20°C以下溫度，在半年內(nèi)使用完畢，不要反復(fù)凍融。模板如具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)或高GC區(qū)域，可將反應(yīng)溫度提高至55℃。

三、miRNA qPCR

* 逆轉(zhuǎn)錄選擇加尾法，qPCR反應(yīng)選擇配套的加尾法qPCR試劑盒，miRNA加尾染料法熒光定量PCR試劑盒（abs60271）

1、配制反應(yīng)體系

取RNase-free離心管，配制如下混合液：

* a）Specific Primer指miRNA的上游特異性引物，即由本公司設(shè)計的正向引物，一般標(biāo)注為：xx-miR-X-X-F，該引物可自行設(shè)計合成，本公司也可免費提供設(shè)計；若使用U6作為參照時，Specific Primer標(biāo)注為U6-Forward Primer。

* b）Tag Primer為本公司專用miRNA反向引物，若使用U6作為參照時，Tag Primer標(biāo)注為 U6-Reverse Primer。

2、設(shè)置反應(yīng)程序

* 儀器類型不同，熔解曲線采集程序不同，使用儀器默認(rèn)熔解曲線采集程序即可。

3、檢測及結(jié)果分析

在適當(dāng)?shù)膓PCR儀器上完成實驗，并分析結(jié)果。

FAQ：

1、miRNA逆轉(zhuǎn)錄&qPCR方法有哪些？

加尾法（常用，一次可以檢測多種miRNA，非常加方便）；

莖環(huán)法（常用，一次只能檢測一種miRNA，但是特異性高）；

探針法（較上面二種方法用的會相對少一些，特異性、靈敏度最高）。

2、miRNA逆轉(zhuǎn)錄加尾法與莖環(huán)法的具體區(qū)別？

1）加尾法：

對所有的miRNA都進(jìn)行polyA加尾，選用通用的逆轉(zhuǎn)錄引物，把所有的miRNA都進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可以分別用于各個miRNA的qPCR的反應(yīng)。一般如果檢測的miRNA數(shù)量比較多的話，比較推薦加尾法做，因為一次性可以逆轉(zhuǎn)錄很多miRNA。（例如要檢測5種miRNA，就選加尾法，買一套試劑盒就能同時測5種）

2）莖環(huán)法：

對每個miRNA進(jìn)行單獨逆轉(zhuǎn)錄，每個miRNA都要有特異的逆轉(zhuǎn)錄引物，同時qPCR引物也是特異的，所以它的特異性比加尾法高，但是一次只能測一種miRNA。當(dāng)miRNA數(shù)量不多，選莖環(huán)會比較好。（例如要檢測1-2種miRNA，并且追求特異性，就選莖環(huán)法。）

3、miRNA逆轉(zhuǎn)錄和miRNA q-PCR一定要配套使用嗎？

是的，因為逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和q-PCR試劑盒里面有成分相互關(guān)聯(lián)，不能分開使用，所以買逆轉(zhuǎn)錄就一定要買對應(yīng)qPCR試劑，并且我們還免費設(shè)計引物。

miRNA莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄配miRNA莖環(huán)法qPCR；

miRNA加尾法逆轉(zhuǎn)錄配miRNA加尾法qPCR；

miRNA探針法逆轉(zhuǎn)錄配miRNA探針法qPCR。

4、哪種miRNA逆轉(zhuǎn)錄&qpCR選擇哪種方法價格便宜呢？

選擇加尾法還是莖環(huán)法，具體是看具體實驗需求，不能以價格來選擇；

加尾法：一套試劑盒價格雖然貴些，但它一次能測多種miRNA，所以樣本量多的情況下價格又便宜了；

莖環(huán)法：一套價格便宜，但是一次只能測一種，如果再測第二種第三種，又要重新設(shè)計引物，買試劑盒，總價格就高了。

5、miRNA引物怎么送？

免費設(shè)計1個miRNA引物，比如需要5個miRNA的引物，那么可以送其中一種，其余4種不送，需要定制合成購買，需要按照要求發(fā)送引物的目的基因。

6、關(guān)于miRNA引物合成，需要給什么信息？

需要發(fā)送引物的目的基因，也就是miRNA名字、ID號、序列，其中miRNA的名字和序列最重要，目的基因需要客戶自己去查詢確定；

一般引物信息格式如下：hsa-miR-22-3p AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU。

7、引物哪些在試劑盒里，哪些不在試劑盒中？U6分別是幾條？

加尾法一套:

miRNA加尾法逆轉(zhuǎn)錄（逆轉(zhuǎn)錄引物，通用的，在試劑盒里面）；

miRNA加尾法qPCR（送上游引物，是特異性引物，要單獨設(shè)計，不在試劑盒里面；下游引物，是通用引物，在試劑盒里面）；

U6內(nèi)參：2條（不送，不在試劑盒里面，需要客戶自己準(zhǔn)備）；

定量U6-F（指U6上游）；定量U6-R（指U6下游）。

莖環(huán)法一套:

miRNA莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄（送莖環(huán)引物，是特異性引物，要單獨設(shè)計，不在試劑盒里面）；

miRNA莖環(huán)法qPCR（送上游引物送，是特異性引物，要單獨設(shè)計，不在試劑盒里面；送下游引物，是通用引物，在試劑盒里面）；

U6內(nèi)參：3條（不送，不在試劑盒里面，要客戶自己準(zhǔn)備。因為莖環(huán)法是特異的，所以它的U6也是要單獨設(shè)計一套）；

U6-NZL（指U6的逆轉(zhuǎn)錄）；U6-F（指U6的上游）；U6-R（指U6的下游）。

探針法一套:

探針法逆轉(zhuǎn)錄（逆轉(zhuǎn)錄引物混在Taqman buffer里）;

探針法qPCR（上游+下游+探針，混在primer mix里，不是獨立的管子）;

U6內(nèi)參（不送，U6上游+U6下游+探針，混合在一個管子，需要客戶自行購買）。

8、U6內(nèi)參是什么？

內(nèi)參是在各類細(xì)胞中普遍存在的一個基因，用于排除由于加樣量差異導(dǎo)致的誤差。做miRNA逆轉(zhuǎn)錄和qPCR實驗過程中是需要內(nèi)參的，客戶一般會選擇合適的基因作為內(nèi)參，不一定非要選擇U6。但一般都是以U6內(nèi)參為主，它是比較常用的。

9、可以發(fā)送試劑盒引物序列嗎？

miRNA引物的序列公司這邊是保密的。如果客戶需要發(fā)表文章必須要用到的情況下可以提供，但是前提是需要客戶在文獻(xiàn)里寫明：設(shè)計與合成來自愛必信（上海）生物科技有限公司，并附上產(chǎn)品貨號。

本期產(chǎn)品推薦：

相關(guān)產(chǎn)品推薦：

[1] Yu X, Odenthal M, Fries JW. Exosomes as miRNA Carriers: Formation-Function-Future. Int J Mol Sci. 2016 Dec 2;17(12):2028. doi: 10.3390/ijms17122028. PMID: 27918449; PMCID: PMC5187828.

[2] Ye J, Xu M, Tian X, Cai S, Zeng S. Research advances in the detection of miRNA. J Pharm Anal. 2019 Aug;9(4):217-226. doi: 10.1016/j.jpha.2019.05.004. Epub 2019 May 25. PMID: 31452959; PMCID: PMC6702429.

[3] 劉念,姚群峰.外泌體miRNA及其作為腫瘤分子標(biāo)志物的研究進(jìn)展[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床,2021,18(03):417-420.

[4] Yan S, Jiang Y, Liang C, Cheng M, Jin C, Duan Q, Xu D, Yang L, Zhang X, Ren B, Jin P. Exosomal miR-6803-5p as potential diagnostic and prognostic marker in colorectal cancer. J Cell Biochem. 2018 May;119(5):4113-4119. doi: 10.1002/jcb.26609. Epub 2018 Jan 25. PMID: 29240249.

[5] Huang Y, Zou Q, Wang SP, Tang SM, Zhang GZ, Shen XJ. The discovery approaches and detection methods of microRNAs. Mol Biol Rep. 2011 Aug;38(6):4125-35. doi: 10.1007/s11033-010-0532-1. Epub 2010 Nov 25. PMID: 21107708.

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