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微生物制劑可加重炎癥性疾病，如多發(fā)性硬化癥(MS)，該疾病研究常用的動物模型為實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)。百日咳毒素(PTX)是微生物制劑的一種，它是一種細菌毒力因子，通常被用作促進EAE的佐劑。

需要注意的是，EAE模型誘導(dǎo)的成功率受多種因素的影響，包括小鼠的種類和性別、百日咳毒素的劑量、佐劑的使用以及豐富的實驗基礎(chǔ)和建模經(jīng)驗。此外，在特定應(yīng)用中，每個批次都要確定最佳劑量。

保存和溶解方法：

保存：我司提供的百日咳毒素為無菌包裝的凍干粉，在真空下密封。重溶前后在4°C下可儲存6個月，避免凍融；

溶解：百日咳毒素溶于水，可用無菌水或無菌緩沖液重溶。使用前，應(yīng)輕柔搖晃，使懸液混合均勻。如果需要長期儲存，可以在高離子強度緩沖液中進行重溶，如無菌0.1M磷酸鈉溶液、pH 7.0；0.5M氯化鈉溶液（注意：溶解時輕柔處理，不要進行劇烈漩渦震蕩）。

EAE模型文獻分享：

在百日咳毒素作為佐劑促進EAE模型的機制探究中，Aline Dumas等人曾報道，PTX會觸發(fā)IL-6介導(dǎo)的信號級聯(lián)反應(yīng)，通過在血管內(nèi)表面爬行來增加巡邏血管的白細胞數(shù)量。隨后，Aline Dumas等人又進一步發(fā)現(xiàn)PTX通過其ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶活性誘導(dǎo)：

1）髓樣細胞中的TLR4信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致促IL-1β合成；
2）一種依賴pyrin的炎性復(fù)合物，將促IL-1β裂解為其活性形式。然后，IL-1β刺激附近的基質(zhì)細胞分泌IL-6。

在沒有pyrin的情況下，PTX不會誘導(dǎo)中性粒細胞與大腦毛細血管的黏附，并且在誘導(dǎo)具有腦源性T淋巴細胞小鼠的EAE方面效果較差。該研究確定了激活pyrin的第一個微生物分子PTX，感染后可能影響MS的機制，也是免疫疾病的潛在治療靶點。

EAE誘導(dǎo)實驗方法：

1、主動免疫誘導(dǎo)EAE

1）小鼠兩側(cè)皮下注射200μL乳劑。乳劑中含有300μg MOG(35-55)肽（溶解于生理鹽水中），并與等量的FCA混合；

2）免疫后即刻和免疫后第2天分別給予小鼠腹腔注射PTX(20μg/kg)。

2、通過過繼轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)EAE

1）給小鼠腹腔注射2×10⁷個從免疫誘導(dǎo)EAE后8天處死的小鼠腹部淋巴結(jié)和脾臟中分離的淋巴細胞；

2）然后在補充有MOG(35-55)肽(15μg/mL)、小鼠IL-12(5ng/mL)、小鼠IL-23(20ng/mL)，F(xiàn)BS(10%)、1%改良的Eagle培養(yǎng)基（含非必需氨基酸）、青霉素(100U/mL)、鏈霉素(100μg/mL)和兩性霉素B(250ng/mL)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天。

3、EAE癥狀的評估

小鼠每日體重和評分如下：

0：無疾病跡象；0.5：部分尾部癱瘓；1：尾部癱瘓；1.5：一側(cè)后肢無力；2：雙后肢無力；2.5：后肢部分癱瘓；3：后肢癱瘓；3.5：前肢部分癱瘓；4：前肢癱瘓；5：因人道原因死亡或死亡。

PTX需要Pyrin來誘導(dǎo)中性粒細胞在血管內(nèi)爬行，并最大限度地促進EAE。

本期小愛為大家介紹了百日咳毒素作為促進EAE模型的佐劑，在使用過程中的注意事項以及文獻常用的造模方法。PTX具有多種生物學(xué)活性，能引起百日咳眾多的臨床癥狀，同時也是主要的免疫原。與大多數(shù)哺乳動物培養(yǎng)細胞結(jié)合并特定靶向G蛋白，抑制G蛋白及其在信號通路中的生理功能。正是依賴Gi家族的蛋白偶聯(lián)受體來抑制信號通路的能力，使得PTX成為細胞生物學(xué)研究中的一種重要工具。

Dumas A , Amiable N , Vaccari J P D R ,et al.The Inflammasome Pyrin Contributes to Pertussis Toxin-Induced IL-1β Synthesis, Neutrophil Intravascular Crawling and Autoimmune Encephalomyelitis[J].PLoS Pathogens, 2014, 10(5):e1004150.

免責(zé)聲明：EAE模型誘導(dǎo)的成功率受多種因素的影響，本文中提供的造模方法來源于已發(fā)表的文獻，僅供您參考，希望對您成功構(gòu)建模型有所幫助。

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