AD背景介紹
阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一種發(fā)病原因不明、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的原發(fā)性腦部神經(jīng)性疾病，是最為常見(jiàn)的癡呆類(lèi)型之一。臨床主要表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶力下降、認(rèn)知功能障礙、行為異常和人格失常等。其典型的病理改變包括神經(jīng)元丟失、β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protenin, Aβ)沉淀形成的老年斑(senile plaque, SP)及tau蛋白過(guò)度磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle, NFT)等[1]。隨著人口老齡化進(jìn)程的不斷加劇，AD已成為國(guó)內(nèi)外關(guān)注的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)。
圖1 a)健康大腦；b)AD大腦中的大腦和神經(jīng)元的生理結(jié)構(gòu)[2]
AD建模方法
目前常用的AD動(dòng)物模型的制備思路主要以體現(xiàn)AD病理、生理、臨床表現(xiàn)特征為導(dǎo)向，模擬AD病理特征制備模型是研究AD的重要手段。AD動(dòng)物模型的建立方法主要包括衰老模型、轉(zhuǎn)基因模型、外源性有害物質(zhì)注入模型等(表1)。例如，研究人員建立了腦內(nèi)直接注射Aβ以誘發(fā)Aβ沉積的老年斑為特點(diǎn)的AD模型。目前主要注射的Aβ為Aβ1-42、Aβ1-40以及Aβ25-35，注射部位主要為單/雙側(cè)海馬CA1區(qū)或者側(cè)腦室，注射時(shí)間可從3天到數(shù)周不等[3-4]。其中，Aβ1-42是AD病理學(xué)研究的主要形式，它形成的核（種子）啟動(dòng)了纖維的形成，導(dǎo)致了經(jīng)典的淀粉樣變性過(guò)程。
表1 常用AD動(dòng)物模型的優(yōu)缺點(diǎn)比較
誘導(dǎo)原理 | 模型 | 優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) |
衰老 | 自然衰老型 | 模型腦內(nèi)神經(jīng)元萎suo、膽堿能功能低下、認(rèn)知障礙。 | 老齡動(dòng)物難以大量獲得、極少神經(jīng)元纖維纏結(jié)及淀粉樣蛋白沉積、造模時(shí)間長(zhǎng)。 |
快速老化型(SAM) | Aβ沉積、葡萄糖代謝的三羧酸循環(huán)異常、免疫功能障礙。 | 成本高、壽命較短。 | |
D-半乳糖(D-gal)模型 | 價(jià)格低廉、神經(jīng)元丟失、蛋白質(zhì)合成減少、學(xué)習(xí)記憶障礙。 | 不能產(chǎn)生AD有的老年斑和神經(jīng)纏結(jié)、不確定因素較多 | |
轉(zhuǎn)基因 | APP轉(zhuǎn)基因型 | 細(xì)胞外Aβ的沉積、神經(jīng)炎斑塊、神經(jīng)元突觸丟失。 | 無(wú)tau蛋白磷酸化及NFT，無(wú)AD海馬及皮層神丟失經(jīng)元。 |
APP/PS-1轉(zhuǎn)基因型 | 皮質(zhì)和海馬區(qū)有Aβ沉積、神經(jīng)元的改變、神經(jīng)行為學(xué)功能障礙。 | 外源性基因表達(dá)不穩(wěn)定，造模費(fèi)時(shí)、繁殖力差,費(fèi)用高。 | |
轉(zhuǎn)tau基因動(dòng)物型 | 腦干和脊髓有NFT的形成、記憶障礙。 | 缺乏Aβ沉積 | |
外源性有害物質(zhì)注入誘導(dǎo) | Aβ注入誘導(dǎo)型 | Aβ沉積、免疫炎癥反應(yīng)、星形膠質(zhì)細(xì)胞增生、tau蛋自過(guò)度磷酸化，ChAT活性顯著下降。 | 不符合AD慢性起病的特點(diǎn)、Aβ聚集在注射位點(diǎn)局部，造模對(duì)腦組織造成非目的損傷。 |
鋁中毒誘導(dǎo)型 | Aβ聚集、神經(jīng)元變性、空間學(xué)習(xí)障礙和記憶損傷。 | 造模周期較長(zhǎng)、中樞膽堿能活性未降低、NFT不同于AD患者。 | |
鏈脲菌素(STZ)型 | tau蛋白高度磷酸化、Aβ沉積、膽堿能的缺失、氧化應(yīng)激。 | 動(dòng)物死亡率較高、無(wú)神經(jīng)纖維纏結(jié)和老年斑。 | |
東莨菪堿誘導(dǎo)型 | 方法簡(jiǎn)便易行、費(fèi)用較低、膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)障礙、認(rèn)知障礙。 | 缺乏AD典型病理特征 |
下面，小愛(ài)分享用Aβ 1-42誘導(dǎo)AD模型的方法[3]。
1、Aβ1-42的配制
(1) 取出儲(chǔ)存于-80°C條件下的人工合成Aβ1-42凍干粉，室溫下平衡30min；
(2) 在通風(fēng)櫥內(nèi)，將 Aβ1-42懸浮于100%HFIP(1.596g/mL)中，濃度為1mM，充分混勻后分裝成等量小份；
(3) 將分裝的等量小份用真空離心蒸發(fā)濃縮器蒸發(fā)掉HFIP，蒸發(fā)后-20°C保存；
(4) 使用前，將上述-20°C保存的小份Aβ1-42重懸于DMSO中，濃度為5mM；
(5) 使用時(shí)，按實(shí)驗(yàn)需要用生理鹽水或者人工腦脊液稀釋至實(shí)驗(yàn)濃度。
2、小鼠單側(cè)側(cè)腦室埋管
(1) 小鼠吸入異氟烷麻醉后，固定于小鼠腦立體定位儀上；
(2) 用75%酒精對(duì)頭部顱頂消毒，剃毛后再次消毒；
(3) 剪開(kāi)頭皮，暴露顱骨，雙氧水去除顱骨表面的結(jié)締組織。顱骨干燥后，再次消毒；
(4) 利用立體定位儀將定位針指向前囟門(mén)(Bregma)并作為起始點(diǎn)，移動(dòng)定位針確定套管位置（前囟前0.46mm、顱骨中線左右各旁開(kāi)1mm、深2.3mm），用顱骨鉆鉆孔，左右側(cè)腦室隨機(jī)放置套管（套管直徑0.48mm、內(nèi)芯直徑0.3mm）；
(5) 用骨膠粘合套管與顱骨之間的縫隙，骨膠干燥后用牙科水泥將套管固定在顱骨上；
(6) 將小鼠轉(zhuǎn)移至電熱毯上，蘇醒后放回飼養(yǎng)盒中，單籠單只飼養(yǎng)；
(7) 注射藥物時(shí)，拔出導(dǎo)管內(nèi)芯，用適宜長(zhǎng)度PE管連接小鼠腦部套管和微量注射針，微量注射泵注射速度為0.5μL/min。
3、行為學(xué)任務(wù)
任務(wù)開(kāi)始前對(duì)各組已完成套管埋置的小鼠注射生理鹽水或者Aβ1-42，微量注射泵注射速度為0.5μL/min，注射2μL。注射完后停針5min防止注射液倒流，然后放回內(nèi)芯，鎖緊螺帽。自發(fā)轉(zhuǎn)換Y迷宮實(shí)驗(yàn)和新異位置識(shí)別任務(wù)：小鼠注射藥物10min后，開(kāi)始自發(fā)轉(zhuǎn)換Y迷宮實(shí)驗(yàn)和新異位置識(shí)別任務(wù)的檢測(cè)。
AD驗(yàn)證方法
理想的模型應(yīng)至少具備以下三個(gè)特征：
①具有AD的主要病理學(xué)特征：SP和NFP。
②出現(xiàn)AD的重要病理變化：神經(jīng)元死亡、神經(jīng)突觸丟失和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生等。
③出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙。
在AD的基礎(chǔ)研究和藥物發(fā)現(xiàn)中，小鼠模型是揭示生物學(xué)機(jī)制、驗(yàn)證分子靶點(diǎn)和篩選潛在化合物的重要資源。轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因小鼠模型都可以在體內(nèi)獲得不同類(lèi)型的AD樣病理。盡管有大量關(guān)于AD致病途徑的遺傳和生化研究，但作為一種以認(rèn)知障礙為主要特征的疾病，任何干預(yù)措施的最終讀數(shù)都應(yīng)該是學(xué)習(xí)和記憶的檢測(cè)[4]。
AD小鼠模型行為分析常用的測(cè)試實(shí)驗(yàn)包括：情境恐懼條件反射、放射臂水迷宮和Morris水迷宮(圖2&3&4)。下面小愛(ài)以文獻(xiàn)[4]為例，詳細(xì)介紹情境恐懼條件反射實(shí)驗(yàn)設(shè)備及操作步驟。
小鼠在一個(gè)調(diào)理室中進(jìn)行單獨(dú)測(cè)試(圖2)，該調(diào)理室位于一個(gè)帶有透明有機(jī)玻璃窗口的音效衰減箱中，可以對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行視頻記錄。調(diào)整室有一個(gè)36bar的隔震格柵地板，地板是可拆卸的，在每個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)象之后，用75%的乙醇清洗，然后再用水清洗。為了提供背景白噪聲(72dB)，在音量衰減室的一側(cè)安裝了單個(gè)計(jì)算機(jī)風(fēng)扇。
在行為實(shí)驗(yàn)之前，每天處理一次小鼠，連續(xù)3天。試驗(yàn)室里一次只放一只動(dòng)物。將其放置在調(diào)理室中2min，然后以2800Hz和85dB的頻率發(fā)出離散音調(diào)(CS)30s。在音調(diào)的最后2s內(nèi)，鼠標(biāo)通過(guò)地板條受到腳部電擊（US，0.50-0.80mA，持續(xù)2s），可調(diào)節(jié)足部電擊的強(qiáng)度來(lái)引發(fā)更強(qiáng)的記憶。在CS/US配對(duì)之后，將小鼠在調(diào)理室中再放置30s，然后將其放回籠子中。凍結(jié)行為可以通過(guò)使用專(zhuān)用軟件進(jìn)行評(píng)分。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，通過(guò)手動(dòng)評(píng)分凍結(jié)時(shí)間進(jìn)行雙重檢查非常有用。訓(xùn)練24h后，將小鼠放回條件反應(yīng)室。凍結(jié)時(shí)間為連續(xù)5min。在訓(xùn)練后36h將小鼠更換為條件箱。通過(guò)插入一個(gè)三角形籠子來(lái)創(chuàng)造一個(gè)新的環(huán)境，籠子的地板是光滑的，帶有香草氣味。2min后（CS前測(cè)試），將小鼠暴露在與訓(xùn)練中使用的音調(diào)特征相同的音調(diào)中3min（CS測(cè)試），并測(cè)定凍結(jié)時(shí)間。通常在每種情況下使用15-20只動(dòng)物。
在測(cè)試恐懼記憶的過(guò)程中需要進(jìn)行的一個(gè)重要控制是感覺(jué)閾值評(píng)估。對(duì)電擊的感官知覺(jué)的改變可能是由于實(shí)驗(yàn)操作導(dǎo)致對(duì)觀察到的表型記憶的錯(cuò)誤歸因。將一系列單腳電擊傳遞給放置在恐懼條件所用相同電網(wǎng)上的動(dòng)物。最初，0.1mA的電擊持續(xù)1s，評(píng)估動(dòng)物的退縮、跳躍和發(fā)聲行為。每隔30s，沖擊強(qiáng)度增加0.1-0.7mA，然后每隔30s以0.1mA的增量恢復(fù)到0mA。通過(guò)平均每只動(dòng)物對(duì)足部電擊表現(xiàn)出行為反應(yīng)的電擊強(qiáng)度，對(duì)每只動(dòng)物的發(fā)聲、退縮和跳躍閾值進(jìn)行量化。
AD的治療
據(jù)報(bào)道，目前全球阿爾茨海默病病例約為2400萬(wàn)例，2050年，癡呆癥患者總數(shù)估計(jì)將增加4倍。盡管AD是一個(gè)公共衛(wèi)生問(wèn)題，但到目前為止，只有兩類(lèi)藥物被批準(zhǔn)用于治療AD，包括膽堿酯酶抑制劑（天然衍生、合成和雜交類(lèi)似物）和N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)拮抗劑[5]。
AD的幾個(gè)生理過(guò)程會(huì)破壞乙酰膽堿生成細(xì)胞，減少膽堿能通過(guò)大腦的傳遞。乙酰膽堿酯酶抑制劑(AChEIs)分為可逆性、不可逆性和偽可逆性，通過(guò)阻斷膽堿酯酶(AChE)和丁基膽堿酯酶(BChE)分解ACh，導(dǎo)致突觸間隙中ACh水平增加而發(fā)揮作用。另一方面，NMDAR的過(guò)度激活導(dǎo)致內(nèi)流的鈣離子水平增加，從而促進(jìn)細(xì)胞死亡和突觸功能障礙。NMDAR拮抗劑阻止NMDAR谷氨酸受體的過(guò)度激活，從而阻止鈣離子內(nèi)流，并恢復(fù)其正?；顒?dòng)。盡管這兩類(lèi)藥物有療效，但它們只對(duì)治療阿爾茨海默病的癥狀有效，但不能治愈或預(yù)防這種疾病。
圖5 已被批準(zhǔn)用于治療AD的小分子藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)式
建立理想的動(dòng)物模型模擬人類(lèi)疾病狀態(tài)有利于開(kāi)展AD病因、發(fā)病機(jī)制及防治的深入研究。目前由于無(wú)法建立很好的AD動(dòng)物模型，所以在進(jìn)行藥物篩選時(shí)，同時(shí)用兩種或兩種以上AD動(dòng)物模型比用單一模型更有說(shuō)服力，同時(shí)也可進(jìn)一步證實(shí)藥物的有效性。
參考文獻(xiàn)
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[2] Breijyeh Z, Karaman R. Comprehensive Review on Alzheimer's Disease: Causes and Treatment [J]. Molecules, 2020, 25, (24).
[3] 呂君妍. Aβ1-42或Aβ1-15改善APP/PS1/Tau轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默癥小鼠記憶的機(jī)制[D]. 華東師范大學(xué), 2023.
[4] A D P, B L L, A A P,et al.Behavioral assays with mouse models of Alzheimer's disease: Practical considerations and guidelines-ScienceDirect[J]. Biochemical Pharmacology, 2014, 88( 4):450-467.
[5] Breijyeh Z, Karaman R,Comprehensive Review on Alzheimer's Disease: Causes and Treatment[J]. Molecules, 2020, 25:5789
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