小伙伴們在上篇學(xué)習(xí)了ELISA實驗的原理、類型，并且根據(jù)自己的需求選擇了適合自己的試劑盒，那接下來就是ELISA的實操了，包括哪些實驗步驟和注意事項呢？快來和小愛一探究竟吧！
ELISA實驗步驟
圖1 ELISA標準實驗流程
1、樣本采集：
a）血漿：采集血漿時可使用EDTA、肝素或檸檬酸鹽作為抗凝血劑。采集后30min內(nèi)，1000xg離心15min。立即檢測或分裝后于≤-20℃儲存。避免反復(fù)凍融。
b）細胞培養(yǎng)上清液：通過離心去除顆粒，立即檢測或分裝后將樣品于≤-20°C儲存。避免反復(fù)凍融。
c）細胞裂解液：在裂解緩沖液中裂解細胞并將其放在冰上靜置30min。14,000xg離心5min除去不溶物。將上清液轉(zhuǎn)移至新管中利用總蛋白分析法定量總蛋白濃度。立即檢測或分裝后將樣品于≤-20°C儲存。
d）乏血小板血漿：在采集血漿時可使用EDTA、肝素或檸檬酸鹽作為抗凝血劑。采集后30min內(nèi)，1000xg離心15min。建議在2-8°C下，10,000xg再次離心10min，以便去除血小板。立即檢測或分裝后于≤-20°C儲存。避免反復(fù)凍融。
e）血清：使用不含抗凝劑的收集管，讓樣品在室溫下凝結(jié)30min，然后1000xg離心15min。立即取出血清并進行檢測或分裝后于≤-20°C儲存。避免反復(fù)凍融。
f）唾液：將唾液收集到管中，10,00xg離心5min。收集水相，立即檢測或分裝后將樣品于≤-20°C儲存。避免反復(fù)凍融。
g）尿液：無菌進行當天shou次尿液的采集(中段尿)，直接排入無菌容器中。離心去除不溶顆粒物質(zhì)。立即檢測或分裝后于≤-20°C儲存。避免反復(fù)凍融。
h）母乳：2-8°C，1000xg離心15min。重復(fù)進行水相部分的收集，總共3次。立即檢測。
i）組織勻漿液：制備方法因組織類型而異。用1XPBS緩沖液沖洗以除去多余血液，使用20mL 1XPBS進行勻漿，并于≤-20°C下儲存過夜。將勻漿液凍融兩次以便破壞細胞膜，然后5000xg離心5min。去除上清液后立即進行檢測，或者分裝后于≤-20°C儲存。避免反復(fù)凍融。
j）組織裂解液：用PBS沖洗組織，將組織切成1-2mm的薄片，用組織勻漿器在PBS中進行勻漿。加入等體積的含蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液，在室溫下裂解組織30min，裂解過程中輕搖裂解液。離心去除沉淀。利用總蛋白質(zhì)分析法定量總蛋白的濃度。立即檢測或分裝后于≤-20°C儲存。
2、預(yù)實驗
ELISA實驗中進行預(yù)實驗是非常有必要的，一方面為了檢測試劑盒是否好用，標曲擬合線性是否良好，最高OD值是否能達到2.0左右，是否存在假陽性假陰性；另外一方面為了檢測樣本最佳稀釋比例，樣本濃度過高要進行稀釋；樣本濃度過低要選擇超敏試劑盒。
3、ELISA實驗對照
1）空白對照：提供背景信號參考，并確保讀取值表示樣品中的分析物濃度。
2）陽性對照：已知含有目標蛋白的內(nèi)源性可溶樣品，或已知含有檢測抗體免疫原的純化蛋白或多肽來作為陽性對照。當樣品的檢測結(jié)果為陰性時，陽性對照的陽性結(jié)果可表明實驗過程無誤且有效，所以實驗的陰性結(jié)果是真實的。
3）陰性對照：已知不表達目標蛋白的樣品。其有助于檢測非特異性結(jié)合和假陽性結(jié)果。
4）標準品：含有已知濃度的目標蛋白的樣品，可從中獲得標準曲線。
5）樣本基質(zhì)中的標準品（加標對照品）：加標對照可用來給出有關(guān)某種特殊樣品基質(zhì)中分析物發(fā)現(xiàn)程度的信息，從而表明檢測性能。比如，在ELISA 中檢測血清樣品時，按照慣例標準品用正常稀釋緩沖液來稀釋。但可以同時用檢測的種屬血清來稀釋標準品。
4、實驗步驟（以Human IL-6 ELISA Kit – Absin，abs510003）
1）準備好所有需要的試劑和標準品；
2）從已平衡至室溫的密封袋中取出微孔，未用的板條請放回鋁箔袋內(nèi)，重新封口；
3）向微孔板中加入300uL洗滌液，靜置浸泡30s，棄掉洗液在吸水紙上將微孔板拍干，請立即使用不要讓微孔板干燥；
4）分別將不同濃度標準品，實驗樣本或者質(zhì)控品加入相應(yīng)孔中，每孔100uL。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育2h;
5）將板內(nèi)液體吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自動洗板機洗板。每孔加洗滌液300uL，然后將板內(nèi)洗滌液吸去。重復(fù)操作3次。每次洗板盡量吸去殘留液體會有助于得到好的實驗結(jié)果。最后一次洗板結(jié)束，請將板內(nèi)所有液體吸干或?qū)宓怪?，在吸水紙拍干所有殘留液體；
6）在每個微孔內(nèi)加入100uL檢測抗體。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育2h；
7）重復(fù)第5步洗板操作；
8）在每個微孔內(nèi)加入100uL SA-HRP，室溫孵育20min。注意避光；
9）重復(fù)第5步洗板操作；
10）在每個微孔內(nèi)加入100uL顯色液，室溫孵育5-30min，注意避光；
11）在每個微孔內(nèi)加入50uL終止液，孔內(nèi)溶液顏色會從藍色變?yōu)辄S色。如果溶液顏色變?yōu)榫G色或者顏色變化不一致，請輕拍微孔板，使溶液混合均勻；
12）加入終止液后30min內(nèi)，使用酶標儀測量450nm的吸光度值，設(shè)定570nm或630nm作為校正波長。如果沒有使用雙波長校正，結(jié)果準確度可能會受影響；
13）計算結(jié)果：將每個標準品和樣品的校正吸光度值（OD450-OD540或OD570）、復(fù)孔讀數(shù)取平均值，然后減去平均零標準品OD值。使用計算機軟件作四參數(shù)邏輯(4-PL)曲線擬合創(chuàng)建標準曲線。另一種方法是，可以通過繪制標準品濃度做對數(shù)與相應(yīng)OD值對數(shù)生成曲線，并通過回歸分析確定最佳擬合線。這個過程可生成一個足夠使用但不太精確的數(shù)據(jù)擬合。若樣本經(jīng)過稀釋，計算濃度時應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。
ELISA操作小技巧
圖2 ELISA操作小技巧
ELISA常見問題
常見問題 | 原因 | 解決方法 |
無信號或信號低，但標準曲線正常 | 樣本中無目標分子或目標分子濃度低于試劑盒檢測范圍 | 更換可以檢測濃度更低的試劑盒或?qū)颖具M行濃縮 |
樣本中的基質(zhì)效應(yīng)干擾了目標蛋白與抗體結(jié)合 | 用適當?shù)南♂屢簩颖具M行濃縮梯度處理，檢測稀釋的線性度是否良好，設(shè)置加標對照品 | |
標準品和樣品都無信號或信號低 | 標準品問題；標準品毀壞(樣品孔有信號)；標準品重溶方法是否正確 | 重新使用一瓶新的標準品，待標準品恢復(fù)室溫后，按照說明書加入提及的稀釋液，充分溶解15min |
顯色試劑是否有效；顯色時間不充足 | 進行color test；增加顯色時間 | |
實驗條件與操作問題 | 孵育溫度，時間，是否需要振蕩器，酶標儀是否設(shè)置正確等 | |
信號強 | 樣本中檢測分子的濃度高，超出試劑盒檢測范圍 | 對樣本進行適當?shù)南♂?/span> |
洗滌不充分，殘留有未結(jié)合的過氧化物酶 | 按照說明書進行充分洗滌(洗板機，增加洗滌次數(shù)) | |
板孔有干掉的情況 | 洗滌和加樣的過程中速度要快一些 | |
顯色液、終止液未及時使用 | 顯色液、終止液盡量現(xiàn)配現(xiàn)用 | |
CV值高或者重復(fù)性差 | 洗板不規(guī)范導(dǎo)致washing buffer殘留，使后加的反應(yīng)試劑濃度不穩(wěn)定 | 洗滌步驟嚴格按照說明書操作 |
顯色試劑不穩(wěn)定，各板孔的抗體不穩(wěn)定，不均一 | 盡量選擇質(zhì)量有保障的試劑盒 | |
實驗溫度問題 | 保持溫度適當且無明顯變化 | |
實驗操作問題 | 嚴格要求操作細節(jié) |
Absin產(chǎn)品線：
爆款產(chǎn)品：試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測、殘留檢測、多因子檢測)；細胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質(zhì)膠，胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細胞因子)、分化試劑盒；分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒)；化合物大包裝；輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標記/檢測)...
特色產(chǎn)品：雞胚提取物CEE、B27、N2、霍亂毒素B亞單位CTB、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX、重組人胰島素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...
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