冷凍保存細(xì)胞之方法?
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ (-20 ℃30 分鐘*) → -80 ℃16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存。
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下, 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 ℃不可超過1 小時, 以防止冰晶過大,造成細(xì)胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中,惟存活率稍微降低一些。
產(chǎn)品屬性:
商品介紹:
名稱 HMy2.CIR (B淋巴母細(xì)胞) 別稱Hmy.2 CIR; HMy2.CIR; C1R 種屬人類 年齡(性別)33歲 組織來源B淋巴母細(xì)胞 生長特性懸浮細(xì)胞 細(xì)胞形態(tài)淋巴母細(xì)胞樣 背景描述HMy2.CIR細(xì)胞是ARH-77細(xì)胞株的快速生長突變株Hmy.2B經(jīng)γ射線照射,選擇HLAI型抗原表達(dá)缺失的細(xì)胞而得到的細(xì)胞株。HMy2.CIR細(xì)胞不表達(dá)HLAA位點(diǎn)和B位點(diǎn)的產(chǎn)物,但表達(dá)少量HLACw4。HMy2.CIR細(xì)胞適于用作I型主要組織相容性抗原基因的轉(zhuǎn)染宿主。有報道稱,ARH-77細(xì)胞呈EB核抗原陽性(EBNA+)和EB病毒莢膜抗原陽性(EBVCA+)。由于Hmy2.CIR細(xì)胞起源于ARH-77細(xì)胞株的快速生長突變株Hmy.2B,推測HMy2.CIR細(xì)胞也是EBNA+。 生物安全等級2 生長培養(yǎng)基IMDM+10% FBS+1% P/S 推薦傳代比例3×10^5-1×10^6cells/mL 推薦換液頻率2~3次/周 凍存條件 凍存液:55% 基礎(chǔ)培養(yǎng)基+40%FBS+5%DMSO 溫度:液氮 培養(yǎng)條件 氣相:空氣,95%;CO2,5% 溫度:37℃ 注意事項該細(xì)胞為懸浮細(xì)胞,請注意離心收集細(xì)胞懸液;請勿直接倒掉細(xì)胞培養(yǎng)液。 |
實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及說明:
1.本方法適用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng),而不適用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng),懸浮細(xì)胞可使用滴片法;
2.所使用的蓋玻片應(yīng)該為優(yōu)質(zhì)玻璃,并經(jīng)過鉻酸洗液處理;
3.蓋玻片非常薄,易碎,取放蓋玻片時動作要輕;
4.如果需要更多生長狀態(tài)一致的細(xì)胞,可以使用較大的培養(yǎng)皿,但不宜過大,以避免培養(yǎng)液的浪費(fèi)和增加污染機(jī)率;
5.如果細(xì)胞貼壁生長能力較差,可將蓋玻片在0.5%多聚賴氨酸溶液中浸泡5-10分鐘并自然晾干。
實(shí)驗(yàn)報告:
一、分離與培養(yǎng):
1、無菌條件下,取出1-3d 齡SD大鼠心房組織,然后用PBS將此組織塊清洗2次,將成1mm3左右大小;
2、往組織塊中加入4 mL酶消化液(0.1% 和0.1% I型膠原酶),混懸10s,置37℃條件下消化10min,之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液,自然沉淀并收集上清,用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置;
3、剩下的組織再加入3~4mL酶消化液,混懸10s,置37℃消化10 min后,按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置,重復(fù)此步驟2-3次,直至組織*被消化;
4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液,1200r/min 離心10min,棄去上清,沉淀細(xì)胞用含有10% FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸,接種于25cm2培養(yǎng)瓶,放置于37℃ ,5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng);
5、差速貼壁1h后,吸出培養(yǎng)基,按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng);
二、免疫熒光鑒定:
1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時,棄去培養(yǎng)基,用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次,每次10min,然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min;
2、PBS沖洗細(xì)胞2次,每次10min,然后在4℃條件下,用0.1%Triton X-100透膜15min;
3、PBS沖洗細(xì)胞2次,每次10min,然后在室溫條件下,用4% BSA封閉細(xì)胞30min;
4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗,然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜;
5、PBS沖洗細(xì)胞3次,每次10min,按1:150的比例稀釋抗α-actin的二抗, 37℃條件下放置1h;
6、用PBS沖洗3次,每次10min,在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。
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1瓶 M1細(xì)胞株 M1 低溫運(yùn)輸和保存
MPC瓊脂培養(yǎng)基 MPC Agar Medium 250g
5mg 堿性 ( 大腸桿菌 ) Phosphatase Alkaline(E.coli) -20℃保存
100mL TB Solution-III TB Solution-III 常溫保存
5次 包涵體中量純化試劑盒 Inclusion Body Midiprep Kit 常溫保存(和核酸清除劑需要-20℃保存,包涵體溶解液室溫保存)
2 ug pSUOER-retro-neo/GFP pSUOER-retro-neo/GFP 低溫運(yùn)輸,-20℃保存