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材料
1．轉(zhuǎn)化細胞的制備經(jīng)過原代或傳代培養(yǎng)的細胞。
2．培養(yǎng)用液克隆適應培養(yǎng)液、Hanks液、0.125％胰蛋白酶。
3．培養(yǎng)用品包括直徑為0.5mm，長為8mm的毛細玻璃管，培養(yǎng)瓶皿、培養(yǎng)板（24孔、96孔）、吸管、微量加樣器等。
方法
1．稀釋克隆法
（1)毛細管克隆法
1)將一定量的細胞懸液（如105個／ml或更低）倍比稀釋至1個／ml;
2）取l0ml稀釋的細胞懸液，用直徑為0.5mm，長為8mm的毛細玻璃管若干（30～50支），在負壓作用下，將懸液吸入各毛細管中；
3）在倒置顯微鏡下檢查出每管只有1個細胞的毛細管，然后放入適應性培養(yǎng)基或有飼養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)瓶（皿）內(nèi)，置37℃ ,5% CO2孵箱中培養(yǎng)。當一個細胞在毛細管內(nèi)繁殖后向管外擴展時，會形成單細胞克隆的細胞群體。
(2）有限稀釋鋪板法：有限稀釋需將細胞懸液在一排試管中進行梯變倍數(shù)稀釋，然后將稀釋的細胞懸液接種于微孔培養(yǎng)板（也可在96孔板上直接稀釋），使每孔僅含1個細胞。經(jīng)鏡下檢測，標記下含單細胞的孔，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)。數(shù)日后，凡在已標記的孔中有生長增殖的細胞集落即為克隆細胞。
1)低密度細胞懸液的制備：選用對數(shù)生長期的狀況良好的待克隆細胞，如為貼壁細胞則先用胰蛋白酶消化，使其脫離瓶壁，經(jīng)反復吹打使細胞相互分離，用培養(yǎng)液梯變倍數(shù)稀釋細胞，分別稀釋成50/m1,10/m1,5/ml三種稀釋度的細胞懸液。
2)接種：先用吸管輕輕吹打細胞懸液，使之混懸均勻。將三種稀釋度的細胞分別用加樣器接種于96孔培養(yǎng)板，每孔分別加100ul細胞懸液（100ul內(nèi)平均細胞分別為5,1,0.5個細胞）和100ul培養(yǎng)液。接種時要迅速準確，爭取在zui短時間內(nèi)加完，以免培養(yǎng)液蒸發(fā)。迅速蓋好蓋板，置于37℃,5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3）標記與培養(yǎng)：培養(yǎng)6～12小時待細胞下沉并貼附于培養(yǎng)板孔底后，從溫箱中取出培養(yǎng)板，置于倒置顯微鏡臺上，觀察和標記下含單個細胞的孔。以單個細胞落于孔底平坦部而周邊清晰者為符合要求。然后，送回C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)期間視其pH的變化決定是否換液或補加培養(yǎng)液。
4）分離擴大培養(yǎng)：將接種細胞培養(yǎng)72～96小時后進行觀察。挑選生長良好的單細胞克隆孔。先吸去舊培養(yǎng)液，用Hanks液洗1～2次。然后加胰蛋白酶溶液少許進行消化。置于倒置顯微鏡下觀察，待細胞變圓時，加入0.1 ml含10％胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化。用吸管輕輕吹打，當細胞脫壁懸浮后，一并吸入24孔板或另一培養(yǎng)瓶中，補加一定量培養(yǎng)液，置C02培養(yǎng)箱中擴大培養(yǎng)。待形成新的細胞群體后，即轉(zhuǎn)用常規(guī)培養(yǎng)法培養(yǎng)。
2．飼養(yǎng)層克隆法分離的單個細胞和密度極低的分散細胞很難存活和增殖，為了促使剛剛克隆化的極少量細胞生長繁殖，常采用“飼養(yǎng)細胞（feeder cell)”促進克隆細胞的增殖。常用的飼養(yǎng)層細胞有成纖維細胞、胸腺細胞和巨噬細胞等。
(1)飼養(yǎng)層的制備：取人或動物胚胎成纖維細胞，待轉(zhuǎn)化細胞生長至旺盛的對數(shù)生長期時，用60Coγ射線以40～60Gy單次照射細胞，其目的是使細胞喪失有絲分裂能力，但仍可短期存活，有代謝功能，不僅可維持pH值而且還可為克隆細胞提供必要的養(yǎng)分及其刺激生長因子。將飼養(yǎng)層細胞制備成細胞懸液，接種入培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24～48小時，便可直接作飼養(yǎng)細胞之用。
(2）接種細胞：先將經(jīng)60Coγ射線照射過的飼養(yǎng)細胞準備好待用；然后取生長至指數(shù)增生期的用作克隆的細胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后制備成細胞懸液，細胞計數(shù)并將其稀釋成20～200/ml;棄掉飼養(yǎng)細胞瓶內(nèi)培養(yǎng)液，注入稀釋的待克隆細胞懸液。做飼細胞層克隆細胞時，還應設對照組，對照組中只接種待克隆細胞懸液，沒有飼細胞層。
(3）克隆形成：將待克隆的細胞懸液接種到飼養(yǎng)細胞層后，培養(yǎng)2～3周，每周換液一次，待克隆出現(xiàn)后，或分離，或計算克隆形成率。
3．膠原膜板或血纖維蛋白膜層板克隆法原代培養(yǎng)細胞容易黏附于膠原膜層或血纖維蛋白膜層等生長基質(zhì)成分之上。在細胞克隆中，用膠原膜層或血纖維蛋白膜層代替飼養(yǎng)細胞，可幫助單個細胞和密度極低的分散細胞都附著貼壁、存活并逐漸繁殖。以血纖維蛋白膜層板為例介紹細胞克隆技術。
(1)血纖維蛋白膜層的制備
1)取0.2ug凝血酶溶于l00ml克隆培養(yǎng)液中，制成A液；另取250mg牛血纖維蛋白原，800mg NaCl和25 mg枸櫞酸鈉，共溶于l000ml重蒸水中，制成B液。
2)取B液1ml和A液4ml，放入培養(yǎng)皿內(nèi)盡快混合，幾分鐘后即形成透明膠層。
(2）消化、接種和培養(yǎng)待克隆細胞
1)取處于對數(shù)生長期的培養(yǎng)細胞，用胰蛋白酶溶液消化后制備細胞懸液。
2)用培養(yǎng)液稀釋細胞懸液，一般以每一培養(yǎng)器皿內(nèi)生長1～10個克隆的細胞濃度為zui適。例如，克隆效應為5％～10％時，則一個器皿內(nèi)接種100個細胞為宜。
3）將細胞懸液按所需數(shù)目種入鋪有生物基質(zhì)層的培養(yǎng)器皿內(nèi)，于C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每周換培養(yǎng)液1次。
(3)觀察并計數(shù)克隆之數(shù)目：幾周后可見有由500～1000個細胞形成的群落。
4．軟瓊脂克隆分離法瓊脂層是一種簡單的生長基質(zhì)層，可幫助細胞貼附生長。但瓊脂中含有酸性硫酸多糖，對大多數(shù)細胞有一定的抑制作用。對于正常貼壁細胞在軟瓊脂中不能形成克隆，本法僅適于懸浮培養(yǎng)的淋巴細胞或惡性程度高的貼壁細胞。目前多用半固體培養(yǎng)基克隆方法。
(1)制備細胞懸液：將對數(shù)生長期細胞制成單個細胞懸液（貼壁細胞用0.25%胰蛋白酶消化，使之分散成單個細胞），做活細胞計數(shù)，調(diào)整細胞密度至（1～5)×104個細胞／L。
(2）制備底層瓊脂：取5％瓊脂置沸水浴中使瓊脂*溶化，取出1份5％瓊脂移入小燒杯中，待冷卻至50℃，迅速加入9份預溫37℃的新鮮培養(yǎng)液（即成為0.5％瓊脂），均勻后立即澆入24孔培養(yǎng)板中，每孔含0.5％瓊脂培養(yǎng)基0. 8ml，置室溫使瓊脂凝固備用（此層也可以省略）。
(3)制備上層瓊脂：取37℃保溫的不同密度的細胞懸液9.4ml移入小燒杯中，加入50℃的5%瓊脂0.6ml，迅速混勻，即配成0.3％瓊脂培養(yǎng)基，立即澆入鋪有（或無）底層瓊脂的24孔培養(yǎng)板中，每孔加0.8 ml，置室溫使瓊脂凝固。每孔細胞數(shù)量可根據(jù)細胞生長速度和實驗目的來確定。一般可調(diào)整每孔含25,50和100個細胞的梯度密度。
(4)培養(yǎng)與觀察：培養(yǎng)板于37℃ ,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2周或更長，若需培養(yǎng)更長時間，每孔可補加0.8ml含瓊脂的培養(yǎng)液，注意觀察培養(yǎng)液的顏色變化和有無明顯集落形成，培養(yǎng)液變酸要及時換液，集落形成要計數(shù)克隆數(shù)或取克隆細胞擴大增殖。
【結果及注意事項】
1．觀察結果并集落（克?。┯嫈?shù)在倒置顯微鏡下觀察結果，計數(shù)直徑大于75 um或含有50個細胞以上的集落。經(jīng)培養(yǎng)后能夠增殖形成克隆的百分率稱集落（克?。┬纬陕? cloning efficiency)，以下述公式計算。

2．克隆形成率與接種細胞的密度有一定的相關性。細胞懸液的細胞密度越大，接種時每平方厘米培養(yǎng)皿上接種的細胞越多，克隆的形成率就越低。為提高克隆形成率，須將細胞懸液稀釋成密度為10/ml，甚至更低，接種的密度也要小。見表3-2。

3．細胞克隆形成率低于10％應采取增強細胞同化能力的措施。如①選定克隆形成效率比較高的培養(yǎng)液作為zui適的克隆化培養(yǎng)液；②用胎牛血清作培養(yǎng)液中的血清成分，比小牛血清*；③調(diào)控C02濃度，C02可提高絕大多數(shù)細胞克隆形成率，常用5％濃度。對有的細胞，如人成纖維細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞克隆時，2％的C02效果可能更好。HEPES (20mmol/L )與2％的C02配合使用能很好緩沖培養(yǎng)液pH值的波動，使細胞盡量少受這一因素的影響。
適應培養(yǎng)基中加入添加細胞刺激因子，某些激素（如胰島素、地塞米松等）和生長因子有促進細胞克隆形成的作用。含1～lOIU/ml胰島素的培養(yǎng)液對許多種細胞的克隆形成均有促進作用。地塞米松也能提高人正常神經(jīng)膠質(zhì)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞、成纖維細胞、黑色素瘤細胞等的克隆形成率。而表皮生長因子可促進角質(zhì)細胞、成纖維細胞和軟骨細胞等生長，推薦使用濃度為1～20ng/ml。
4．飼養(yǎng)細胞在體外培養(yǎng)時，單個細胞和密度極低的分散細胞很難存活和逐漸繁殖。飼養(yǎng)細胞為克隆細胞創(chuàng)造了適宜生長的微環(huán)境。飼養(yǎng)細胞也稱滋養(yǎng)細胞，是一層經(jīng)過射線照射處理的、供其他細胞附著的細胞層。飼養(yǎng)細胞受射線照射后，失去其分裂能力，但仍存活并有同化營養(yǎng)液的能力，待克隆的細胞散落在飼養(yǎng)細胞上層并與之接觸。細胞克隆形成后，飼養(yǎng)細胞逐漸死亡，換液時可被清除。
5．增強轉(zhuǎn)化細胞的貼壁能力以促進細胞克隆形成一種簡單的生長基質(zhì)層是瓊脂層，常用濃度為2%。瓊脂層制備后，可把細胞接種在瓊脂層上。惡變細胞或惡性轉(zhuǎn)化細胞在軟瓊脂(1.2%）中的生長，與在裸鼠體內(nèi)的致瘤性有很大一致性。因此測試細胞能否在軟瓊脂中生長，已成為測試轉(zhuǎn)化細胞惡性的重要指標。原代培養(yǎng)的細胞易貼附于膠原層或血漿纖維蛋白層生長基質(zhì)上。用多聚右旋賴氨酸（poyrylysine）包被培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿底壁，能提高用低血清培養(yǎng)的人成纖維細胞克隆形成率。其包被方法是：①配制濃度為1mg/ml的多聚右旋賴氨酸水溶液，用以濕潤培養(yǎng)瓶底；②倒出多聚賴氨酸溶液，用5m1 PBS沖洗培養(yǎng)瓶皿1次后，即可立即使用。用培養(yǎng)液配制的濃度為5 ug/ml的纖維粘連蛋白（fibronectin )處理培養(yǎng)瓶后亦有類似效應。