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解析轉(zhuǎn)化細胞培養(yǎng)方法
閱讀：757 發(fā)布時間：2017-8-29轉(zhuǎn)化細胞比乳鼠心肌難養(yǎng)，用無血清培養(yǎng)基，呈桿狀，橫紋清楚，在培養(yǎng)基里細胞不搏動。
大鼠心肌細胞分離一般是采用二型膠原酶分離，濃度為1mg/ml（用無鈣臺氏液配制），同時酶液里加入?；撬?，BSA。一般采用Langendorff灌流的方法，大鼠開胸后，迅速取出心臟，放入冰的臺氏液中，找到主動脈后，掛上Langendorff裝置，衡流泵灌入無鈣臺氏液（37度），開始心臟會搏動幾下，這樣把心臟中的淤血擠出（此處也有人用有鈣臺氏液灌流，好讓心臟充分搏動，把淤血擠出，不過我們摸索發(fā)現(xiàn)只要取心臟到掛上去的時間短，一般搏動幾下就能把淤血清楚干凈了）。幾分鐘后，換酶液開始灌流心臟，一般開始時，心臟較軟，待消化一段時間后變硬，繼續(xù)消化后又變軟，且心臟發(fā)白，這時候就可以停止消化，將心室剪下，放入KB液中，用剪刀剪碎后，用滴管吹打，取上清，繼續(xù)加入KB液，吹打，直到上清液不渾濁為止，一般吹打3－4次即可。將各次上清合并，吹打過濾后，沉降20分鐘左右，棄上清，加入無血清培養(yǎng)基（MEM，不含L－谷氨酰胺，并加入肌酸，?；撬?，BSA，肉毒堿，HEPES），吹打，1000轉(zhuǎn)/分離心半分鐘，棄上清，再洗1－2次后，將沉淀加入到6％的BSA中沉降15－20分鐘（純化心肌細胞），然后計數(shù)，點板或培養(yǎng)。
此法中如果各步注意無菌操作，zui后先用加倍雙抗的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，再換正常培養(yǎng)基，可適用于條件不是很好的試驗室。如果能在板或瓶內(nèi)加入Laminin處理后，貼壁很好。如果分離出來的心肌細胞，逐級復(fù)鈣后培養(yǎng)，狀態(tài)更好。*狀態(tài)此中方法能培養(yǎng)7天以上。
膠原酶對膠原的消化作用強，它僅對細胞間質(zhì)有消化作用而對細胞沒有影響，可使上皮細胞和膠原成分分離而不受損害，相反，胰酶作用時間長會對對細胞產(chǎn)生破壞作用。因此我覺得你的細胞狀態(tài)不好可能不是膠原酶的原因。我也在養(yǎng)心肌細胞，消過程中也會有你說的蛋清一樣的狀態(tài)，但沒有是整個上清都是的情況，可能正如青山兄所說是你的胰酶放得太少了，5只老鼠可以放3ml的胰酶，我聽師兄說這種蛋清樣的東東含的細胞zui多，所以要劑量把它吸出來，另外我認(rèn)為吸的時候切勿把組織塊吸上來，我試過吸的組織塊過多，離心后組織快都還飄在懸液中，一倒就把牽有轉(zhuǎn)化細胞的組織塊一塊到走了，到zui后所得的細胞就少很多。
先擠一會再剪，剪心室，大概就是心臟的下半部分。放入另一干凈的PBS溶液中，再洗洗。0.1％的胰酶每次消化大概10分鐘左右，吹打后，靜置1分鐘左右，然后吸取上清，加入胰酶繼續(xù)消化。
13292-46-1 300mg Rifampin 利福平標(biāo)準(zhǔn)品
132-98-9 200mg Penicillin V Potassium 青霉素V鉀標(biāo)準(zhǔn)品
133107-64-9 5.97mg Insulin Lispro 賴脯胰島素標(biāo)準(zhǔn)品(2-8℃)
13311-84-7 200mg Flutamide 氟他胺標(biāo)準(zhǔn)品
13345-51-2 25mg 前列腺素B1標(biāo)準(zhǔn)品
133481-09-1 30mg 加巴噴丁相關(guān)物質(zhì)B標(biāo)準(zhǔn)品
133627-17-5 15mg 奈韋拉平相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品
133-67-5 200mg Trichlormethiazide 三氯噻嗪標(biāo)準(zhǔn)品
轉(zhuǎn)化細胞