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轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)物污染的源頭
閱讀：334 發(fā)布時(shí)間：2018-1-25轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)物污染——培養(yǎng)物可被細(xì)菌、酵母、真菌、病毒、支原體、甚至其他細(xì)胞種類所污染。各種污染都會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生錯(cuò)誤的結(jié)果。支原體污染——支原體污染在所有培養(yǎng)細(xì)胞中的比例為5-35%，它可改變細(xì)胞生長(zhǎng)特性，酶的作用途徑，細(xì)胞膜的組成，染色體結(jié)構(gòu)，以及轉(zhuǎn)染效率。特別是，支原體對(duì)采用脂質(zhì)、DEAE-右旋糖酐、磷酸鈣或腺病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)有所干擾，其結(jié)果致使非典型轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染效率偏低。這些影響會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不可靠以及時(shí)間和珍貴細(xì)胞系的損失。和細(xì)菌及真菌不同，支原體污染無(wú)法通過(guò)視覺(jué)檢查發(fā)現(xiàn)。它們非常小甚至能夠通過(guò)大多數(shù)的無(wú)菌濾膜;它們還對(duì)常用抗生素有抗藥性。所以必需進(jìn)行支原體污染的常規(guī)篩查。
要素二：載體DNA 一般原則：對(duì)純化所得的載體進(jìn)行質(zhì)量鑒定。確定維持其正常功能的基因序列是否適合于您的細(xì)胞體系。在測(cè)定細(xì)胞體系的參數(shù)時(shí)，一定要選用一種已知具有功能的載體做對(duì)照。 載體的完整性——載體是否具有功能取決于它結(jié)構(gòu)的完整性。轉(zhuǎn)染效率受到質(zhì)粒制備物的超螺旋結(jié)構(gòu)和舒展結(jié)構(gòu)之間比例、雙螺旋斷裂、核酸酶的降解，以及來(lái)自于儲(chǔ)存和處理過(guò)程中的物理壓力的影響。載體制備物——各種載體是按照不同的方案在細(xì)菌體系中制備并純化。制備產(chǎn)物中殘余的污染物(如CsCl，內(nèi)毒素)可能會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。載體構(gòu)造(啟動(dòng)子/增強(qiáng)子/ORI)—轉(zhuǎn)染體系通常用帶有強(qiáng)病毒調(diào)節(jié)元件(如，RSV，CMV，和SV40)的對(duì)照載體進(jìn)行優(yōu)化和比較。然而，病毒啟動(dòng)子/增強(qiáng)子體系的相對(duì)有效性在不同細(xì)胞系間的差異可大到兩個(gè)數(shù)量級(jí)。例如，在某些細(xì)胞系中，由于自發(fā)的質(zhì)粒擴(kuò)增，SV40體系可表達(dá)large T抗原(如，COS);而在其他許多細(xì)胞系中，則是CMV啟動(dòng)子更為有效。 除此之外，各種CMV載體的表達(dá)率也會(huì)有超過(guò)一個(gè)數(shù)量級(jí)的差異，這部分是由于載體中其他調(diào)節(jié)元件所引起的。
要素三：組織培養(yǎng)試劑 一般原則：優(yōu)化您的細(xì)胞生長(zhǎng)條件。只使用新鮮配制的培養(yǎng)基和添加劑，并盡可能減少所用試劑的變更?；A(chǔ)培養(yǎng)基——培養(yǎng)基的成分包括營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(氨基酸，葡萄糖)，維生素，無(wú)機(jī)鹽，和緩沖物質(zhì)。轉(zhuǎn)化細(xì)胞有些成分非常不穩(wěn)定，因此如果在使用時(shí)不是新鮮，加入就可能會(huì)產(chǎn)生問(wèn)題。配置時(shí)要使培養(yǎng)基務(wù)必避光保存;因?yàn)橐阎幸恍┙M分和緩沖物質(zhì)，如HEPES，當(dāng)暴露于光照下就會(huì)分解產(chǎn)生細(xì)胞毒性物質(zhì)。 胎牛血清——血清是一種含有白蛋白、球蛋白、生長(zhǎng)促進(jìn)因子和生長(zhǎng)抑制因子的極為復(fù)雜的混和物。采集血清所用動(dòng)物的年齡、營(yíng)養(yǎng)水平和健康狀況可影響到血清中這些成分的數(shù)量和質(zhì)量，從而引起顯著生物學(xué)變化。
半胱胺酸蛋白酶蛋白-7IgG 小鼠膽堿磷酸甘油酯(PC/CPG)
半胱天冬酶-3酶原IgG 小鼠膽堿磷酸甘油酯(PC/CPG)
半乳糖激酶1IgG 小鼠膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)
半乳糖凝集素-3IgG 小鼠單核趨化蛋白4(MCP-4/CCL13)
半乳糖凝集素IgG 小鼠大內(nèi)皮素(Big ET)
伴肌動(dòng)蛋白IgG 小鼠催乳素(PRL)
包含氧化還原酶的WW域IgG 小鼠催產(chǎn)素(OT)
胞漿-5´-核苷酸酶-ⅡIgG 小鼠促性腺激素釋放激素(GnRH)
胞漿環(huán)氧化物水解酶IgG 小鼠促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)
轉(zhuǎn)化細(xì)胞