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非洲豬瘟病毒熒光定量 PCR 試劑盒處理注意事項
閱讀：583 發(fā)布時間：2019-8-22非洲豬瘟病毒熒光定量 PCR 試劑盒處理注意事項
1. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 DNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級版柱式病毒 DNAout。
非洲豬瘟病毒熒光定量 PCR 試劑盒(染料法) ASFC qPCR Kit（Dye based） CAT#:14-23000
2. 標(biāo)記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
3.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
4.在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
5.換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
6.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
7.換槍頭，在 4 號管中加 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照到 4 號管中，得 1×10E4 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
8.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20 μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）
9.在 PCR 管中加入下列成分（待測樣品需要做三次重復(fù)，下表只列出一次。樣品管
和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：
成分 樣品 陰性對照 陽性對照（2-7 管）
2×qPCR MagicMix 10 μL 10 μL 各 10 μL
引物混合物 2 μL 2 μL 各 2 μL自備 10×ROX (見注) 2 μL 2 μL 各 2 μL
待測樣品 DNA 模板 6 μL 不加 不加
各 6μL（2 號樣到陽性對照（2-7 號） 不加 不加 2 號管，3 號樣到 3
號管…）
注:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用ROX 作為對照，其他熒光 PCR 儀器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，則用水替代。
10.蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行
優(yōu)化）。
過程 溫度 時間
預(yù)變性 94℃ 5 分鐘
PCR 反應(yīng)
（30 個循環(huán)） 94℃ 60 秒
50℃ 60 秒
72℃ 60 秒
11.數(shù)據(jù)采集
具體操作按所用儀器推薦的流程進(jìn)行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合 DNA 時， 大吸收光譜在 471 nm，結(jié)合 DNA 時的大吸收光譜在 500 nm，大發(fā)射光譜在 530 nm。信號采集可以設(shè)置在復(fù)性或延伸步驟。
二、稀釋陽性對照（以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，
因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成
分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染xing病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照， 只提供可以直接使用的 DNA 片段作為陽性對照。