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ATCC菌種快速增菌培養(yǎng)基檢測效果的研究
閱讀：801 發(fā)布時間：2017-7-13為了驗證對于ATCC菌種特異性、復蘇效果以及快速生長的特點，比較了3種培養(yǎng)基對于大腸桿菌O157:H7的增菌效果。研究結(jié)果表明，8h培養(yǎng)時間內(nèi)，MicroFast快速增菌培養(yǎng)基對于冷損傷和熱損傷的大腸桿菌O157:H7菌株具有良好的修復和增殖效果。MicroFast快速增菌培養(yǎng)基營養(yǎng)組分適合O157菌株的生長需求，在MicroFast快速增菌培養(yǎng)基中，大腸桿菌O157:H7菌株的倍增時間為13.5min，遠高于mEC+n的28min，且MicroFast快速增菌培養(yǎng)基對于大腸桿菌O157:H7菌株具有良好的選擇特異性，能夠短時間內(nèi)（8h內(nèi)）有效富集培養(yǎng)大腸桿菌O157:H7菌株，是一種能夠?qū)崿F(xiàn)大腸桿菌O157:H7菌株快速、特異增殖的培養(yǎng)基，將其結(jié)合檢測金標卡，能夠?qū)崿F(xiàn)8h內(nèi)快速檢測，結(jié)果可信可靠。
關鍵詞：MicroFast快速增菌培養(yǎng)基 大腸桿菌O157:H7 增菌 效果
目前，病原微生物污染防控是食品安全的剛性需求，微生物污染是食品不合格的主要原因，也是造成食物中毒的主要原因，尤其以細菌性食物中毒為主，食品中大腸桿菌污染率zui高達到了41.1%，大腸桿菌O157則為3.7%[1]。腸出血性大腸桿菌O157:H7是腸出血性大腸桿菌(EHEC)的一個血清型，是引起食源性疾病主要血清型[2]，主要臨床癥狀為突發(fā)性腹痛、腹瀉、血便，嚴重時并發(fā)腎衰竭，病死率高。大腸桿菌O157:H7主要污染肉類食品[3，4]，蔬菜中也時有檢出[5]，是食品中潛在危害巨大的食源性致病菌。因此，快速、特性、的檢出食品中大腸桿菌O157:H7，對于其引起的食源性疾病防控以及暴露病例的治療具有重要的意義。本文比較了MicroFast快速增菌培養(yǎng)基（簡稱MF培養(yǎng)基）、改良EC肉湯培養(yǎng)基（簡稱：mEC+n）和FP培養(yǎng)基對大腸桿菌O157:H7的增菌效果，以期驗證不同培養(yǎng)基的增菌優(yōu)勢和特異性，為探索省時、、特異的快速檢測方法提供依據(jù)。
1 材料與方法
1.1菌種
大腸埃希氏菌O157:H7（ATCC12478/NCTC12900）為實驗用標準陽性菌株。
大腸桿菌FSCC146255/146264、ATCC25922/8739、CMCC44102/44103（Escherichia coli）、腸桿菌ATCC14028/ 43864/49027（Enterobacteria），沙門氏菌CICC21482 CMCC 50333/50220/50115/ 50335（Salmonella），李斯特氏菌ATCC 19115、CMCC54002/ 22260（Listeria），假單胞菌ATCC 27853、CMCC10104（Pseudomonas），枯草芽孢桿菌ATCC 6633、CMCC63501（Bacillus subtilis），為特異性檢測用菌株。
1.2 培養(yǎng)基
MicroFast快速增菌培養(yǎng)基，簡稱MF培養(yǎng)基，北京良潤生物科技有限公司；改良EC肉湯培養(yǎng)基，簡稱為mEC+n培養(yǎng)基，按照GB 4789.36-2008規(guī)定步驟配置，備用；FP培養(yǎng)基，國外某品牌培養(yǎng)基。
1.3 儀器設備
紫外可見分光光度計（UV-2450），日本島津；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（GHP-9270），金壇市城東久久實驗儀器廠；凈化工作臺（YJ-875），吳江市華都凈化設備公司；自動電熱壓力蒸汽滅菌器（LDZX-40C1），上海申安醫(yī)療器械廠；電子天平（BSA323S），北京賽多利斯。
1.4 方法
1.4.1 培養(yǎng)基的制備
按照說明書或者GB 4789規(guī)定的要求和步驟進行，按照需要制作液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。
1.4.2 菌株修復
將陽性標準菌株進行制備熱損傷和冷損傷。熱損傷菌體制備：將標準陽性菌株的菌懸液（108~109cfu/mL）置于55℃水浴鍋、加熱15min后取出，室溫冷卻30min，定義為熱損傷菌體細胞，備用。冷損傷菌體制備：將菌懸液置于-20℃冰箱、冷凍2h，然后取出室溫預熱30min，定義為冷損傷菌體細胞，備用；正常對照組：未做處理的菌懸液，定義為正常組菌體細胞。將相同濃度的大腸埃希氏菌O157菌懸液菌，分別按照上述規(guī)定的方法進行菌體損傷處理，36±1℃、培養(yǎng)8h后，稀釋進行平板計數(shù)，每組做5個平行，取平均值。
1.4.3 生長速度
吸取0.2mL大腸埃希氏菌O157 NCTC12900的菌懸液（108~109cfu/mL），按照2%的接種量，分別接種到盛有10mL MF培養(yǎng)基、mEC+n培養(yǎng)基和FP培養(yǎng)基的18×180mm試管中，每組10支試管，36±1℃培養(yǎng)，每隔1h測定其OD600吸光度值，每只試管測3次，取平均值繪制其生長曲線。同時通過平板計數(shù)法計數(shù)對數(shù)期各時間點的ATCC菌種形成單位數(shù)，計算倍增時間。
1.4.4 特異性
無菌吸取0.2mL對照標準菌株菌懸液（108~109cfu/mL），接種于盛有10mL不同培養(yǎng)基中，36±1℃、培養(yǎng)18h，觀察培養(yǎng)管的渾濁程度，統(tǒng)計結(jié)果。
2 結(jié)果與分析
2.1 MF培養(yǎng)基、mEC+n培養(yǎng)基和FP培養(yǎng)基對菌株復蘇效果
熱損傷、冷損傷往往導致細菌菌體細胞生理狀態(tài)的破壞，部分成為存活但不能培養(yǎng)的菌體細胞(viable but non-euhurable state，VBNC），無法再常規(guī)培養(yǎng)基增殖生長[6]，具體到食品衛(wèi)生微生物檢測，由于培養(yǎng)基的差異或者營養(yǎng)成分的缺失，往往不適合VBNC菌體細胞的增殖，從而無法計數(shù)檢測VBNC，增加了假陰性的幾率。圖1表明，熱或冷損傷菌體細胞在MF培養(yǎng)基上復蘇效果好于mEC+n培養(yǎng)基和FP培養(yǎng)基，尤其是高于GB 4789.36-2008規(guī)定培養(yǎng)基計數(shù)值的3個數(shù)量級，說明MF培養(yǎng)基成分能夠利于O157菌株的復蘇和增殖，促進損傷細胞的復蘇，特別是8h培養(yǎng)時間，遠遠低于GB常規(guī)檢測規(guī)定的時間，具有耗時短，增殖復蘇效果好的特點，適合快速檢測的前期培養(yǎng)和目的菌株的初分離。
2.2 MF培養(yǎng)基、mEC+n培養(yǎng)基和FP培養(yǎng)基對菌株生長影響
大腸埃希氏O157:H7標準菌株在3種培養(yǎng)基上生長速度存在差異（如圖2），盡管菌體在3種培養(yǎng)基上進入對數(shù)生長期的時間接近，但對數(shù)生長期的菌體生長速度各異，MF培養(yǎng)基、FP培養(yǎng)基均優(yōu)于GB 4789.36-2008規(guī)定的mEC+n培養(yǎng)基，MF培養(yǎng)基生長速度zui快，其倍增時間zui短，尤其是對于冷損傷菌體（如圖3），表現(xiàn)出良好的修復和增殖功效，說明MF培養(yǎng)基組分適合大腸埃希氏菌O157:H7的生長，提供生長因子滿足其增殖的要求。
2.3 MF培養(yǎng)基、mEC+n培養(yǎng)基和FP培養(yǎng)基抑菌情況
特異性驗證結(jié)果表明（見表1），MF培養(yǎng)基、mEC+n培養(yǎng)基和FP培養(yǎng)基均能夠較好的抑制G+細菌，李斯特氏菌、枯草芽孢桿菌在3種培養(yǎng)基上均檢測不到菌落的形成，說明培養(yǎng)基能夠有效抑制G+生長，減少了假陽性結(jié)果，提高了可信度。對于G-細菌，MF培養(yǎng)基均能抑制沙門氏菌、腸桿菌、假單胞菌和大腸桿菌，尤其對于大腸桿菌的抑制，說明MF培養(yǎng)基對于O157:H7特異性強，具有良好的選擇性。mEC+n培養(yǎng)基抑制效果相對較弱，不能夠很好地抑制大腸桿菌、腸桿菌和假單胞菌。3種培養(yǎng)基均能選擇性地培養(yǎng)O157:H7菌株，MF培養(yǎng)基特異性要優(yōu)于其他2種培養(yǎng)基，mEC+n培養(yǎng)基選擇性zui弱。食品衛(wèi)生微生物檢測中選擇性培養(yǎng)基的特異性是檢測結(jié)果的基石，其選擇性高低決定著結(jié)果的可靠、可信程度，尤其快速檢驗逐漸將成為主流檢測方法，因此選擇性培養(yǎng)基特異性更加重要。實驗結(jié)果說明，MF培養(yǎng)基對于O157的檢測具有優(yōu)良的特異性，其選擇性培養(yǎng)結(jié)果可信可靠，優(yōu)于同類培養(yǎng)基產(chǎn)品。
3.討論
微生物污染是食品不合格的主要原因，也是造成食物中毒的主要病因，尤其細菌性污染往往是食源性疾病暴發(fā)的主要誘因。大腸桿菌O157:H7作為腸出血性大腸桿菌的一種，其往往侵染肉類及其制品，蔬菜及其制品中也時有報道。目前，常規(guī)方法檢測O157需要18~24初分離培養(yǎng)，生化鑒定、血清分型等步驟，往往耗時、費力，不利于食源性疾病病例的對癥治療，也不利于污染食品的后期處理，因此快速、特異可靠的快檢方法逐漸成為食品衛(wèi)生檢驗微生物檢驗以及食源性疾病病因檢測的理想方法。實現(xiàn)快速檢測可以從三方面考慮[7]：其一，實驗設備簡化；其二，前處理方法簡單快速；其三，簡單、快速和準確地判定分析方法。由此可知，微生物檢測中提高選擇性培養(yǎng)基的特異性、快速性以及可信度，可以大大縮短檢測時間，提高檢測快速性。針對大ATCC菌種的MicroFast快速增菌培養(yǎng)基及其快速檢測組合方法能夠滿足食品中O157快檢以及食源性疾病病因快速檢測的要求。