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引物是決定PCR 結(jié)果的關(guān)鍵，下列原則有助于引物的合理設(shè)計(jì)
閱讀：536 發(fā)布時(shí)間：2019-5-28 PCR 技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、省時(shí)、靈敏度高特異性強(qiáng)和對(duì)原始材料質(zhì)量要求低等優(yōu)點(diǎn)，但由于所用的TaqDNA 聚合酶缺乏5'—3'核酶外切酶活性，不能糾正反應(yīng)中發(fā)生的錯(cuò)誤核苷酸摻入，估計(jì)每9000個(gè)核苷酸會(huì)導(dǎo)致一個(gè)摻入錯(cuò)誤，不過(guò)Innis M·A 發(fā)現(xiàn)，錯(cuò)誤摻入的堿基有終止鏈延伸的作用傾向，使得錯(cuò)誤不會(huì)擴(kuò)大。
PCR 技術(shù)應(yīng)用廣泛，不可能有這樣一套條件滿足所有的實(shí)驗(yàn)，但本實(shí)驗(yàn)所介紹的方法可適應(yīng)于大多數(shù)DNA 擴(kuò)增反應(yīng)，即使有的不適應(yīng)，至少也確定了一個(gè)共同的起點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上可以作多種變化。不過(guò)下列因素在實(shí)驗(yàn)應(yīng)用時(shí)應(yīng)予以特別注意，以求取得滿意結(jié)果。
1、模板：?jiǎn)?、雙鏈DNA 和RNA都可以作為PCR樣品，若起始材料是RNA，須先通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄得取條cDNA。雖然PCR 可以僅用極微量的樣品，但為了保證反應(yīng)的特異性，一般宜用ng 量級(jí)的克隆DNA，ug 級(jí)的染色體DNA，待擴(kuò)增樣品質(zhì)量要求較低，但不能混合有任何蛋白酶、核酸酶，Taq DNA聚合酶的抑制劑以及能結(jié)合DNA 的蛋白質(zhì)。
2、引物：引物是決定PCR 結(jié)果的關(guān)鍵，下列原則有助于引物的合理設(shè)計(jì)。
（1）盡可能選擇堿基隨機(jī)分布，GC 含量類(lèi)似于被擴(kuò)增片段的引物，盡量避免具有多聚嘌呤、多聚嘧啶或其它異常序列的引物。
（2 ）避免具有明顯二級(jí)結(jié)構(gòu)（尤其是在引物3'—末端）的序列。
（3 ）防止引物間的互補(bǔ)，特別要注意避免具有3'末端重疊的序列。
（4）引物的長(zhǎng)度約為20個(gè)堿基，較長(zhǎng)引物較好，但成本增加，短引物則特異性降低。
（5）引物濃度不宜偏高，過(guò)高易形成二聚體，而且擴(kuò)增微量靶目標(biāo)或起始材料是粗制品，容易產(chǎn)生非特異產(chǎn)物。