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微生物菌種的研究進(jìn)展
閱讀：527 發(fā)布時(shí)間：2017-7-24一，微生物菌種發(fā)酵工藝研究進(jìn)展
在丁酸梭菌的液態(tài)培養(yǎng)方面，戚薇等采用單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化得到*培養(yǎng)基組成為（g/L）：胰蛋白胨10，葡萄糖8，酵母膏4。于37℃培養(yǎng)24 h，活菌數(shù)可達(dá)4.1×108 CFU/mL，培養(yǎng)基中添加K2HPO4 5 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、MnSO4·H2O 0.2 g/L、CaCO3 1 g/L，培養(yǎng)32 h，活菌數(shù)芽孢轉(zhuǎn)化率可達(dá)95%，也簡(jiǎn)化了培養(yǎng)基成分。其中，的工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基被確定為每升培養(yǎng)液中含有8 g 葡萄糖、20 g 豆粕（中性蛋白酶水解3 h）和5 g 啤酒酵母粉，zui適培養(yǎng)條件下培養(yǎng)48h，丁酸梭菌活菌數(shù)可達(dá)8×108 CFU/mL，使成本降低了90%。至于固態(tài)發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用，王海寬等在丁酸梭菌固態(tài)發(fā)酵方面已經(jīng)獲得了授權(quán)，丁酸梭菌活菌數(shù)大于1.0×109 CFU/g。
此外，Hakalehto 等發(fā)現(xiàn)CO2 是梭狀芽孢桿菌生長(zhǎng)的一個(gè)必要的信號(hào)，在丁酸梭菌的純培養(yǎng)過(guò)程中，外部環(huán)境中沒(méi)有CO2 將導(dǎo)致其生長(zhǎng)的大量延遲或難以啟動(dòng)；丁酸梭菌與短乳桿菌存在著共生關(guān)系，同時(shí)短乳桿菌產(chǎn)生的CO2 能夠更好地啟動(dòng)丁酸梭菌的生長(zhǎng)。亦有學(xué)者利用丁酸梭菌跟鼠李糖乳桿菌、雙歧桿菌、酵母菌混合培養(yǎng)來(lái)制備丁酸梭菌復(fù)合制劑，并將其作為醫(yī)藥和飼料添加劑應(yīng)用于人類和養(yǎng)殖動(dòng)物。
二，丁酸梭菌在臨床上的應(yīng)用
60 多年前，日本就已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了丁酸梭菌的商業(yè)化，自此，丁酸梭菌先后被用作人用處方藥、非處方藥、獸藥、飼料添加劑及保健食品等，且丁酸梭菌制劑在國(guó)內(nèi)外臨床應(yīng)用已有幾十年的歷史。
我國(guó)對(duì)丁酸梭菌作為益生菌劑的研究起步于20 世紀(jì)90 年代，經(jīng)過(guò)20 余年的動(dòng)物試驗(yàn)以及臨床上的應(yīng)用，證實(shí)丁酸梭菌的急性毒素實(shí)驗(yàn)和艾姆斯試驗(yàn)均呈安全性，丁酸梭菌制劑能有效治療嬰幼兒功能不健全、正常菌群失調(diào)、腸易激綜合癥和輔助治療鵝口瘡、反復(fù)呼吸道感染、手足口病等相關(guān)疾病，以及放療和化療造成的免疫功能下降。
2004 年，青島東海藥業(yè)有限公司的丁酸梭菌制劑被國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)為新藥，2005 年3 月，口服丁酸梭菌膠囊、片劑和散劑的通過(guò)了國(guó)家食品和藥品監(jiān)督管理局的GMP 認(rèn)證，隨后作為非處方藥全面上市，使中國(guó)成為第二個(gè)實(shí)現(xiàn)丁酸梭菌制劑產(chǎn)業(yè)化的國(guó)家。
1. 嬰幼兒功能不健全相關(guān)疾病
人腸道菌群的建立始于新生兒被分娩的過(guò)程，出生后的嬰兒則從母親的皮膚及乳汁、身邊的物體、周圍的空氣等環(huán)境中得到細(xì)菌“種子”，而某些“種子”的缺乏將導(dǎo)致微生態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制不健全，同時(shí)由于新生兒機(jī)體功能不健全，諸如兒童營(yíng)養(yǎng)不良、早產(chǎn)兒喂養(yǎng)不耐受、新生兒高膽紅素血癥等相關(guān)疾病具有較高的發(fā)病率。
丁酸梭菌在防治早產(chǎn)兒喂養(yǎng)不耐受和治療兒童營(yíng)養(yǎng)不良的臨床應(yīng)用，證實(shí)了丁酸梭菌活菌散能加速腸黏膜上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和早產(chǎn)兒腸道發(fā)育成熟，促進(jìn)腸蠕動(dòng)，恢復(fù)腸動(dòng)力；產(chǎn)生多種消化酶和葉酸、B 族維生素等，促進(jìn)食物的消化、吸收和補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從而有效的治療兒童營(yíng)養(yǎng)不良和早產(chǎn)兒喂養(yǎng)不耐受。在預(yù)防治療新生兒黃疸中，丁酸梭菌產(chǎn)生的丁酸，降低了β-葡萄糖醛酸苷酶的活性，競(jìng)爭(zhēng)性地阻止結(jié)合膽紅素分解為非結(jié)合膽紅素，減少肝腸循環(huán)，同時(shí)促進(jìn)腸蠕動(dòng)加快，促進(jìn)排便，增加膽紅素的排泄，從而有效的（P<0.05）減輕新生兒黃疸的程度、降低高膽紅素血癥的發(fā)生率。
2. 正常菌群失調(diào)的相關(guān)疾病
由于宿主的神經(jīng)性、功能性或器質(zhì)性的改變，或致病性細(xì)菌、病毒乃至霉菌的入侵，或服用抗菌藥物等都會(huì)導(dǎo)致正常菌群失調(diào)而引起小兒急性腹瀉、小兒秋冬季腹瀉、繼發(fā)性腹瀉、病毒性腹瀉、抗生素相關(guān)性腹瀉、腸易激綜合癥等相關(guān)疾?。荒c道有害菌移位產(chǎn)生的內(nèi)源性感染，先天性免疫失調(diào)引發(fā)的免疫紊亂等，都將導(dǎo)致腸道局部黏膜受損，進(jìn)而引發(fā)相關(guān)的腸道炎癥（慢性末端回腸炎、潰爛性結(jié)腸炎和壞死性小腸結(jié)腸炎等），而丁酸梭菌產(chǎn)生的丁酸能抑制去乙?；富钚?、產(chǎn)生的葉酸參與基因的甲基化和去甲基化，調(diào)節(jié)宿主的基因表達(dá)，從而預(yù)防和治療腸炎、腸癌。
目前，丁酸梭菌制劑的臨床應(yīng)用于治療正常菌群失調(diào)引起的相關(guān)疾病的療效顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且無(wú)不良反應(yīng)?？股叵嚓P(guān)性腹瀉是幽門螺桿菌*治療過(guò)程中導(dǎo)致腸道微生態(tài)功能失調(diào)的副作用，而在微生物菌種*治療過(guò)程的同時(shí)，服用一定劑量的丁酸梭菌制劑，結(jié)果在治療組未發(fā)現(xiàn)腹瀉的情況，亦沒(méi)有檢測(cè)到艱難梭菌毒素A。丁酸梭菌制劑治療慢性末端回腸炎療效顯著（有效率97.5%），大便性狀、腹部疼痛、腸鳴音得到明顯改善，其機(jī)理是TOLL-樣受體4 能夠識(shí)別丁酸梭菌導(dǎo)致IL-10 的分泌，而IL-10 在抵消機(jī)體過(guò)度免疫應(yīng)答方面起重要作用，丁酸梭菌產(chǎn)生的丁酸能加強(qiáng)腸黏膜的能量、營(yíng)養(yǎng)代謝，抑制炎癥因子的過(guò)度表達(dá)，修復(fù)胃黏膜，提高機(jī)體免疫。
3. 輔助治療
鵝口瘡、反復(fù)呼吸道感染、手足口病等疾病是由致病性微生物等直接引起的疾病，在常規(guī)臨床治療的同時(shí)利用丁酸梭菌制劑進(jìn)行輔助治療，頗具成效，形成了新的治療理念。
鵝口瘡是兒科常見(jiàn)多發(fā)病癥，是由念珠菌感染引起的口腔黏膜急性假膜性損害，甚至引起念珠菌性食道炎或肺念珠菌病，出現(xiàn)呼吸困難而危機(jī)生命，但常規(guī)治療后短期易復(fù)發(fā)。鄒積茹等現(xiàn)丁酸梭菌制劑能夠促進(jìn)腸黏膜大量分泌免疫球蛋白sIgA，sIgA 是黏膜免疫的主要抗體并血液循環(huán)到達(dá)口腔黏膜，丁酸梭菌還能促進(jìn)巨噬細(xì)胞的功能以增強(qiáng)細(xì)胞免疫，聯(lián)合制霉菌素對(duì)鵝口瘡進(jìn)行治療，治療結(jié)果顯著，且復(fù)發(fā)率大大降低（P<0.05），丁酸梭菌活菌散與制霉菌素片聯(lián)用治療嬰幼兒鵝口瘡是一種理想的選擇，值得臨床推廣應(yīng)用。
反復(fù)呼吸道感染是小兒常見(jiàn)病，發(fā)病率達(dá)20%左右。張永紅等證實(shí)丁酸梭菌、雙歧桿菌二聯(lián)活菌散對(duì)反復(fù)呼吸道感染尤其是反復(fù)上呼吸道感染具有預(yù)防和治療作用，發(fā)熱時(shí)間、咳嗽緩解時(shí)間、咽和扁桃體紅腫消退時(shí)間以及肺部濕啰音消失時(shí)間都顯著短于對(duì)照組（P<0.05），可作為兒科臨床上反復(fù)呼吸道感染患兒的一種治療選擇。手足口病是由腸道病毒引發(fā)，病毒在腸黏膜內(nèi)繁殖并持續(xù)釋放到血液，當(dāng)利用丁酸梭菌制劑輔助治療手足口病時(shí)，患兒的皰疹消失時(shí)間、體溫恢復(fù)正常時(shí)間均明顯短于對(duì)照組。丁酸梭菌制劑具有抑制病毒代謝、繁殖和促進(jìn)機(jī)體細(xì)胞免疫、體液免疫等功效，為手足口病提供了一種新的治療方法。
三，動(dòng)物飼料中應(yīng)用
食物傳染疾病的爆發(fā)強(qiáng)調(diào)了減少動(dòng)物器官食物中病原菌的必要性，動(dòng)物腸內(nèi)病原菌是食物污染的直接來(lái)源，世界對(duì)抗生素抗性基因能夠從動(dòng)物轉(zhuǎn)移到人類的廣泛關(guān)注，導(dǎo)致歐盟決定自2006 年1 月1日禁止使用抗生素作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑。丁酸梭菌制劑成為替代抗生素的一種理想選擇，既能減少抗生素的使用所引起的抗藥性、二重感染等，又能提高動(dòng)物的自然防御機(jī)制和經(jīng)濟(jì)效益。我國(guó)農(nóng)業(yè)部已于2009 年7 月批注了丁酸梭菌制劑作為微生物飼料添加劑的使用。
1. 作為動(dòng)物益生菌制劑
在韓國(guó)，丁酸梭菌制劑已經(jīng)被用于牛、豬和家禽的飼料添加劑。國(guó)內(nèi)諸多研究證實(shí)丁酸梭菌發(fā)酵能夠使飼料酸化軟化，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和適口性；在動(dòng)物體內(nèi)以優(yōu)勢(shì)搶占空間生態(tài)位和營(yíng)養(yǎng)生態(tài)位，產(chǎn)生多種益生物質(zhì)，提高飼料利用率；保持動(dòng)物腸道內(nèi)微生物菌群正常化，產(chǎn)生丁酸梭菌素，抑制腸道有害菌，提高動(dòng)物抗病力、免疫力，減少死淘率以及降低糞便中NH3、H2S 的含量，但目前丁酸梭菌制劑還未被普遍的作為益生菌劑添加于動(dòng)物飼料。孫梅等研究成果是采用微膠囊化包埋丁酸梭菌，以提高丁酸梭菌作為飼料添加劑的使用效果。經(jīng)研究確定丁酸梭菌在采用4% 的海藻酸鈉和2% 的明膠混合物作為壁材的包埋劑中活菌數(shù)能增殖至4.9×109 CFU/mL， 包埋率達(dá)99.5%。微膠囊顆粒具備良好的穩(wěn)定性、耐熱性、腸溶性，耐酸性及耐膽鹽性試驗(yàn)前后活菌數(shù)量差異不顯著（P>0.05），但耐胃酸及耐膽鹽較未包埋的對(duì)照組有顯著提高。zui終為微膠囊化丁酸梭菌作為飼料添加劑的實(shí)際應(yīng)用奠定一定的理論基礎(chǔ)。
2. 改善動(dòng)物的性能
丁酸梭菌制劑能減少動(dòng)物飼料中抗生素、類激素類物質(zhì)的使用，改善動(dòng)物的性能，提高禽畜肉蛋奶制品產(chǎn)量和魚(yú)類的受精率、產(chǎn)卵量、孵化率及魚(yú)苗成活率。家禽腸道絨毛的長(zhǎng)度與其腸上皮細(xì)胞數(shù)量呈顯著正相關(guān)。當(dāng)絨毛變長(zhǎng)時(shí)，腸上皮細(xì)胞數(shù)增多，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力增高。在1 日齡AA 肉雞中添加0.9% 丁酸梭菌能顯著提高腸道絨毛長(zhǎng)度，從而也能顯著提高肉雞平均日增重量，且試驗(yàn)組的發(fā)病率和死淘率均顯著低于對(duì)照組。在肉雞的飼料中添加適量的丁酸梭菌，盲腸消化物的pH 和盲腸的相對(duì)長(zhǎng)度降低顯著，空腸黏膜上的堿性磷酸酶活性以及盲腸中的短鏈脂肪酸相對(duì)增加，暗示食用油和丁酸梭菌相互作用對(duì)肉雞腸道產(chǎn)生了健康的影響。
丁酸梭菌制劑可以顯著提高種鴨蛋的受精率。機(jī)理是丁酸梭菌在腸道內(nèi)可產(chǎn)生多種維生素和酶等物質(zhì)，有助于促使種番鴨對(duì)鈣、磷、錳、鋅、銅和鐵等的吸收，滿足種番鴨繁殖性能的需要，提高種公鴨的精液品質(zhì)及種蛋的受精率，又避免了使用抗生素而產(chǎn)生的種種弊端。
3. 改善動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量
丁酸梭菌制劑能調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道微生態(tài)平衡以及治療相關(guān)動(dòng)物疾病，有效地減少二重感染和動(dòng)物體內(nèi)的藥物殘留；增加血中蛋白氮的含量，改善蛋白質(zhì)的代謝，能降低血清中的膽固醇水平；產(chǎn)生各種益生物質(zhì)，利于補(bǔ)充必需的營(yíng)養(yǎng)，維持機(jī)體正常生理功能，促進(jìn)代謝，改善畜禽漁產(chǎn)品質(zhì)量，進(jìn)而保證畜禽漁產(chǎn)品的質(zhì)量符合、加工、銷售及出口的標(biāo)準(zhǔn)，以沖破貿(mào)易上的“綠色壁壘”。
當(dāng)肉雞的飼料中添加一定劑量的丁酸梭菌時(shí)，肉雞腹部脂肪中的脂蛋白脂肪酶活力、空腸黏膜中肝型脂肪酸結(jié)合蛋白基因的表達(dá)、胸肌中的十二碳五烯酸和n-3 不飽和脂肪酸的含量均增加顯著（P<0.05），同時(shí)肌肉的剪切力明顯降低，而對(duì)于胸肌中的滴水損失，飲食中的油脂（魚(yú)油）和丁酸梭菌存在著極顯著（P<0.01）的交互作用，有力地證明微生物菌種能夠改善肉制品的質(zhì)量和提高肌肉中必要的不飽和脂肪酸含量。