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          膠體金制備注意事項及應用

          閱讀:3074      發(fā)布時間:2021-10-25
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                                                                      膠體金制備注意事項及應用

                                                                  圣賓儀器科技(上海)有限公司

          一、膠體金的穩(wěn)定性及免疫膠體金的貯存

          膠體金具有很高的動力學穩(wěn)定性,在穩(wěn)定因素不受破壞時自身凝聚極慢,可放置數(shù)年不發(fā)生凝聚。影響穩(wěn)定的因素主要有電解質(zhì)、溶膠濃度、溫度、非電解質(zhì)等。

          金溶膠必須有少量電解質(zhì)作穩(wěn)定劑,但濃度不宜過高。高濃度親水性非電解質(zhì)能剝?nèi)ツz粒外面的水化膜使其凝聚。少量的高分子物質(zhì)促使溶膠凝聚,但一定量的高分子物質(zhì)反而可增加溶膠穩(wěn)定性,如蛋白質(zhì)、葡萄糖、PEG20000等的加入有良好的穩(wěn)定效果。

          當金溶膠吸附蛋白質(zhì)后,溶膠的穩(wěn)定性隨溶液pH而變化,而這種變化又取決于吸附蛋白質(zhì)的等電點,如ConA,過氧化物酶等,當pH較低時保持穩(wěn)定,提高pH則顯得不穩(wěn)定,接近等電點或略高時又變得穩(wěn)定了。標記后的膠體金溶液可用0.2~0.5mg/ml PEG20000 作為穩(wěn)定劑。在4~10℃貯存數(shù)月有效,不宜冰凍。貯存中可能會發(fā)生程度不同的凝聚,可離心除去。

          二、制備高質(zhì)量膠體金的注意事項

          (1)玻璃器皿必須*清洗,最好是經(jīng)過硅化處理的玻璃器皿,或用第一次配制的膠體金穩(wěn)定的玻璃器皿,再用雙餾水沖洗后使用。否則影響生物大分子與金顆粒結(jié)合和活化后金顆粒的穩(wěn)定性,不能獲得預期大小的金顆粒。

          (2)試劑、水質(zhì)和環(huán)境:劑配制必須保持嚴格的純凈,所有試劑都必須使用雙餾水或三餾水并去離子后配制,或者在臨用前將配好的試劑經(jīng)超濾或微孔濾膜(0.45µm)過濾,以除去其中的聚合物和其它可能混入的雜質(zhì)。氯金酸極易吸潮,對金屬有強烈的腐蝕性,不能使用金屬藥匙,避免接觸天平稱盤。其1%水溶液在4℃可穩(wěn)定數(shù)月不變。實驗用水一般用雙蒸餾水。實驗室中的塵粒要盡量減少,否則實驗的結(jié)果將缺乏重復性。

          金顆粒容易吸附于電極上使之堵塞,故不能用pH電極測定金溶液的pH值。為了使溶液pH值不發(fā)生改變,應選用緩沖容量足夠大的緩沖系統(tǒng),一般采用檸檬酸磷酸鹽(pH3~5.8)、Tris-HCL (pH5.8~8.3)和硼酸氫氧化鈉(pH8.5~10.3)等緩沖系統(tǒng)。但應注意不應使緩沖液濃度過高而使金溶膠自凝。

          (3)配制膠體金溶液的pH以中性(pH7.2)較好。

          (4)氯金酸的質(zhì)量要求上乘,雜質(zhì)少。最好是進口的。

          (5)氯金酸配成1%水溶液在4℃可保持數(shù)月穩(wěn)定,由于氯金酸易潮解,因此在配制時,最好將整個小包裝一次性溶解。

          三、膠體金技術(shù)的應用

          1、免疫學中的應用

          (1)膠體金在電鏡水平的應用

          膠體金應用電鏡水平的研究最早,發(fā)展最快,應用*泛。其是可以通過應用不同大小的顆?;蚪Y(jié)合酶標進行雙重或多重標記。直徑為3~15nm 膠體金均可用作電鏡水平的標記物。3~15nm 的膠體金多用于單一抗原顆粒的檢測,而直徑15nm 多用于檢測量較多的感染細胞。

          膠體金用于電鏡水平的研究,主要包括:

          ① 細胞懸液或單層培養(yǎng)中細胞表面抗原的觀察。

          ② 單層培養(yǎng)中細胞內(nèi)抗原的檢測。

          ③ 組織抗原的檢測。

          金標記在電鏡水平的應用,主要方法包括:包埋前染色、包埋后染色、免疫負染色、雙標記技術(shù)和原位雜交技術(shù)等。

          實驗證明,該法樣本用量少、檢測速度快、對比明顯、操作簡單、敏感性和特異性高,既可用于抗原檢測,也可用于抗體檢測,因此,可同時適用于科研和診斷。

          (2)膠體金在光鏡水平的應用

          膠體金同樣可用做光鏡水平的標記物,取代傳統(tǒng)的熒光素、酶等。各種細胞涂片、切片均可應用。主要用于:

          ① 用單克窿抗體或抗血清檢測細胞懸液或培養(yǎng)的單層細胞的膜表面抗原。

          ② 檢測培養(yǎng)的單層細胞胞內(nèi)抗原,

          ③ 組織中或亞薄切片中抗原的檢測。

          膠體金用于光鏡水平的研究,可以彌補其它標記物不可避免的本底過高和內(nèi)部酶活性干擾等缺點。

          (3)膠體金在流式細胞儀中的應用:

          應用熒光素標記的抗體,通過流式細胞儀計數(shù)分析細胞表面抗原,是免疫學研究中的重要技術(shù)之一。但由于不同熒光素的光譜相互重疊,區(qū)分不同的標記困難,因此必須尋找一種非熒光素標記物,用于流式細胞計數(shù)。這樣可以同時進行幾種標記。該標記物必須能夠改變散射角,膠體金可以明顯地改變紅激光散射角,因而可以作為流式細胞儀的標記物之一。

          (4)凝集試驗:單分散的免疫金溶膠呈清澈透明的溶液,其顏色隨溶膠顆粒大小而變化,當與相應抗原或抗體發(fā)生專一性反應后出現(xiàn)凝聚,溶膠顆粒極度增大,光散射隨之發(fā)生變化,顆粒也會沉降,溶液的顏色變淡甚至變成無色,這一原理可定性或定量地應用于免疫反應。

          (5)免疫印跡技術(shù)(immunoblotting):免疫印跡是一種較新的免疫化學技術(shù)。用聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白質(zhì)分離,得到的區(qū)帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,然后用酶免疫法(或免疫熒光、RIA)進行定量。

          免疫膠體金也可用于該法的定量。轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜與某特異性的抗體保溫后,再與經(jīng)葡萄球菌A蛋白致敏的膠體金溫育,*洗去多余的膠體金,根據(jù)膜上膠體金顆粒顏色深淺可測知樣品中的特異性抗原。

          利用金顆??纱呋y離子還原成金屬銀這一原理,采用銀顯影劑增強金顆粒的可見性,更可大大提高測定靈敏度,檢測下限可低至 0.1ng,這種免疫金銀染色法應用已日趨廣泛。

          由于膠體金免疫印跡技術(shù)簡便、快速,且有相當?shù)母叩撵`敏度,在臨床免疫診斷上有很大的應用潛力。

          (6)膠體金在肉眼水平的應用

          膠體金取代傳統(tǒng)三大標記物,用于肉眼水平的免疫檢測中。除了膠體金本身具有的特點外,還有以下優(yōu)點:

          ①試劑和樣本用量極小,樣本量可低至1~2ul;

          ②不需γ-計數(shù)器、熒光顯微鏡、酶標檢測儀等貴重儀器,更適于現(xiàn)場應用;

          ③沒有諸如放射性同位素、鄰苯二胺等有害物質(zhì)參與;

          ④實驗結(jié)果可以長期保存;

          ⑤時間大大縮短,提高了檢測速度。

          金標過程中,無共價鍵形成,是一定離子濃度下的物理吸附。因此幾乎所有的大分子物質(zhì)都可被金標記,標記后大分子物質(zhì)活性不發(fā)生改變。實驗結(jié)果表明,膠體金的敏感性可達到 ELISA的水平。而結(jié)合銀染色時,檢測的敏感性更大大提高。

          2、免疫診斷技術(shù)中的應用

          膠體金標記技術(shù)由于標記物的制備簡便,方法敏感、特異,不需要使用放射性同位素,或有潛在致癌物質(zhì)的酶顯色底物,也不要熒光顯微鏡,它的應用范圍廣,除應用于光鏡或電鏡的免疫組化法外,更廣泛地應用于各種液相免疫測定和固相免疫分析以及流式細胞術(shù)等。

                                                                                                                                                    本篇轉(zhuǎn)載至實驗之家

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