膠體金制備注意事項(xiàng)及應(yīng)用
圣賓儀器科技(上海)有限公司
一、膠體金的穩(wěn)定性及免疫膠體金的貯存
膠體金具有很高的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性,在穩(wěn)定因素不受破壞時(shí)自身凝聚極慢,可放置數(shù)年不發(fā)生凝聚。影響穩(wěn)定的因素主要有電解質(zhì)、溶膠濃度、溫度、非電解質(zhì)等。
金溶膠必須有少量電解質(zhì)作穩(wěn)定劑,但濃度不宜過(guò)高。高濃度親水性非電解質(zhì)能剝?nèi)ツz粒外面的水化膜使其凝聚。少量的高分子物質(zhì)促使溶膠凝聚,但一定量的高分子物質(zhì)反而可增加溶膠穩(wěn)定性,如蛋白質(zhì)、葡萄糖、PEG20000等的加入有良好的穩(wěn)定效果。
當(dāng)金溶膠吸附蛋白質(zhì)后,溶膠的穩(wěn)定性隨溶液pH而變化,而這種變化又取決于吸附蛋白質(zhì)的等電點(diǎn),如ConA,過(guò)氧化物酶等,當(dāng)pH較低時(shí)保持穩(wěn)定,提高pH則顯得不穩(wěn)定,接近等電點(diǎn)或略高時(shí)又變得穩(wěn)定了。標(biāo)記后的膠體金溶液可用0.2~0.5mg/ml PEG20000 作為穩(wěn)定劑。在4~10℃貯存數(shù)月有效,不宜冰凍。貯存中可能會(huì)發(fā)生程度不同的凝聚,可離心除去。
二、制備高質(zhì)量膠體金的注意事項(xiàng)
(1)玻璃器皿必須*清洗,最好是經(jīng)過(guò)硅化處理的玻璃器皿,或用第一次配制的膠體金穩(wěn)定的玻璃器皿,再用雙餾水沖洗后使用。否則影響生物大分子與金顆粒結(jié)合和活化后金顆粒的穩(wěn)定性,不能獲得預(yù)期大小的金顆粒。
(2)試劑、水質(zhì)和環(huán)境:劑配制必須保持嚴(yán)格的純凈,所有試劑都必須使用雙餾水或三餾水并去離子后配制,或者在臨用前將配好的試劑經(jīng)超濾或微孔濾膜(0.45µm)過(guò)濾,以除去其中的聚合物和其它可能混入的雜質(zhì)。氯金酸極易吸潮,對(duì)金屬有強(qiáng)烈的腐蝕性,不能使用金屬藥匙,避免接觸天平稱(chēng)盤(pán)。其1%水溶液在4℃可穩(wěn)定數(shù)月不變。實(shí)驗(yàn)用水一般用雙蒸餾水。實(shí)驗(yàn)室中的塵粒要盡量減少,否則實(shí)驗(yàn)的結(jié)果將缺乏重復(fù)性。
金顆粒容易吸附于電極上使之堵塞,故不能用pH電極測(cè)定金溶液的pH值。為了使溶液pH值不發(fā)生改變,應(yīng)選用緩沖容量足夠大的緩沖系統(tǒng),一般采用檸檬酸磷酸鹽(pH3~5.8)、Tris-HCL (pH5.8~8.3)和硼酸氫氧化鈉(pH8.5~10.3)等緩沖系統(tǒng)。但應(yīng)注意不應(yīng)使緩沖液濃度過(guò)高而使金溶膠自凝。
(3)配制膠體金溶液的pH以中性(pH7.2)較好。
(4)氯金酸的質(zhì)量要求上乘,雜質(zhì)少。最好是進(jìn)口的。
(5)氯金酸配成1%水溶液在4℃可保持?jǐn)?shù)月穩(wěn)定,由于氯金酸易潮解,因此在配制時(shí),最好將整個(gè)小包裝一次性溶解。
三、膠體金技術(shù)的應(yīng)用
1、免疫學(xué)中的應(yīng)用
(1)膠體金在電鏡水平的應(yīng)用
膠體金應(yīng)用電鏡水平的研究最早,發(fā)展最快,應(yīng)用*泛。其是可以通過(guò)應(yīng)用不同大小的顆?;蚪Y(jié)合酶標(biāo)進(jìn)行雙重或多重標(biāo)記。直徑為3~15nm 膠體金均可用作電鏡水平的標(biāo)記物。3~15nm 的膠體金多用于單一抗原顆粒的檢測(cè),而直徑15nm 多用于檢測(cè)量較多的感染細(xì)胞。
膠體金用于電鏡水平的研究,主要包括:
① 細(xì)胞懸液或單層培養(yǎng)中細(xì)胞表面抗原的觀察。
② 單層培養(yǎng)中細(xì)胞內(nèi)抗原的檢測(cè)。
③ 組織抗原的檢測(cè)。
金標(biāo)記在電鏡水平的應(yīng)用,主要方法包括:包埋前染色、包埋后染色、免疫負(fù)染色、雙標(biāo)記技術(shù)和原位雜交技術(shù)等。
實(shí)驗(yàn)證明,該法樣本用量少、檢測(cè)速度快、對(duì)比明顯、操作簡(jiǎn)單、敏感性和特異性高,既可用于抗原檢測(cè),也可用于抗體檢測(cè),因此,可同時(shí)適用于科研和診斷。
(2)膠體金在光鏡水平的應(yīng)用
膠體金同樣可用做光鏡水平的標(biāo)記物,取代傳統(tǒng)的熒光素、酶等。各種細(xì)胞涂片、切片均可應(yīng)用。主要用于:
① 用單克窿抗體或抗血清檢測(cè)細(xì)胞懸液或培養(yǎng)的單層細(xì)胞的膜表面抗原。
② 檢測(cè)培養(yǎng)的單層細(xì)胞胞內(nèi)抗原,
③ 組織中或亞薄切片中抗原的檢測(cè)。
膠體金用于光鏡水平的研究,可以彌補(bǔ)其它標(biāo)記物不可避免的本底過(guò)高和內(nèi)部酶活性干擾等缺點(diǎn)。
(3)膠體金在流式細(xì)胞儀中的應(yīng)用:
應(yīng)用熒光素標(biāo)記的抗體,通過(guò)流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)分析細(xì)胞表面抗原,是免疫學(xué)研究中的重要技術(shù)之一。但由于不同熒光素的光譜相互重疊,區(qū)分不同的標(biāo)記困難,因此必須尋找一種非熒光素標(biāo)記物,用于流式細(xì)胞計(jì)數(shù)。這樣可以同時(shí)進(jìn)行幾種標(biāo)記。該標(biāo)記物必須能夠改變散射角,膠體金可以明顯地改變紅激光散射角,因而可以作為流式細(xì)胞儀的標(biāo)記物之一。
(4)凝集試驗(yàn):?jiǎn)畏稚⒌拿庖呓鹑苣z呈清澈透明的溶液,其顏色隨溶膠顆粒大小而變化,當(dāng)與相應(yīng)抗原或抗體發(fā)生專(zhuān)一性反應(yīng)后出現(xiàn)凝聚,溶膠顆粒極度增大,光散射隨之發(fā)生變化,顆粒也會(huì)沉降,溶液的顏色變淡甚至變成無(wú)色,這一原理可定性或定量地應(yīng)用于免疫反應(yīng)。
(5)免疫印跡技術(shù)(immunoblotting):免疫印跡是一種較新的免疫化學(xué)技術(shù)。用聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白質(zhì)分離,得到的區(qū)帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,然后用酶免疫法(或免疫熒光、RIA)進(jìn)行定量。
免疫膠體金也可用于該法的定量。轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜與某特異性的抗體保溫后,再與經(jīng)葡萄球菌A蛋白致敏的膠體金溫育,*洗去多余的膠體金,根據(jù)膜上膠體金顆粒顏色深淺可測(cè)知樣品中的特異性抗原。
利用金顆??纱呋y離子還原成金屬銀這一原理,采用銀顯影劑增強(qiáng)金顆粒的可見(jiàn)性,更可大大提高測(cè)定靈敏度,檢測(cè)下限可低至 0.1ng,這種免疫金銀染色法應(yīng)用已日趨廣泛。
由于膠體金免疫印跡技術(shù)簡(jiǎn)便、快速,且有相當(dāng)?shù)母叩撵`敏度,在臨床免疫診斷上有很大的應(yīng)用潛力。
(6)膠體金在肉眼水平的應(yīng)用
膠體金取代傳統(tǒng)三大標(biāo)記物,用于肉眼水平的免疫檢測(cè)中。除了膠體金本身具有的特點(diǎn)外,還有以下優(yōu)點(diǎn):
①試劑和樣本用量極小,樣本量可低至1~2ul;
②不需γ-計(jì)數(shù)器、熒光顯微鏡、酶標(biāo)檢測(cè)儀等貴重儀器,更適于現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用;
③沒(méi)有諸如放射性同位素、鄰苯二胺等有害物質(zhì)參與;
④實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以長(zhǎng)期保存;
⑤時(shí)間大大縮短,提高了檢測(cè)速度。
金標(biāo)過(guò)程中,無(wú)共價(jià)鍵形成,是一定離子濃度下的物理吸附。因此幾乎所有的大分子物質(zhì)都可被金標(biāo)記,標(biāo)記后大分子物質(zhì)活性不發(fā)生改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,膠體金的敏感性可達(dá)到 ELISA的水平。而結(jié)合銀染色時(shí),檢測(cè)的敏感性更大大提高。
2、免疫診斷技術(shù)中的應(yīng)用
膠體金標(biāo)記技術(shù)由于標(biāo)記物的制備簡(jiǎn)便,方法敏感、特異,不需要使用放射性同位素,或有潛在致癌物質(zhì)的酶顯色底物,也不要熒光顯微鏡,它的應(yīng)用范圍廣,除應(yīng)用于光鏡或電鏡的免疫組化法外,更廣泛地應(yīng)用于各種液相免疫測(cè)定和固相免疫分析以及流式細(xì)胞術(shù)等。
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