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          微生物實(shí)驗(yàn)用菌種的保存方法

          閱讀:3079      發(fā)布時(shí)間:2021-11-27
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                                                                    微生物實(shí)驗(yàn)用菌種的保存方法

                                                                  圣賓儀器科技(上海)有限公司

          微生物實(shí)驗(yàn)用菌種是進(jìn)行新產(chǎn)品研發(fā)和生產(chǎn)質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。為了保證微生物實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確靈敏和人員及環(huán)境的衛(wèi)生安全,特制定以下規(guī)定:

            1. 菌種采集。實(shí)驗(yàn)室用菌種一是到國家法定機(jī)構(gòu)采購,二是購買ATCC菌種,三是科研中菌種交流。不管是哪種來源,均由公司統(tǒng)一采集。采集中嚴(yán)格按照規(guī)范執(zhí)行。要求包裝可靠,采集迅速,不泄漏不污染。保證菌種合格和環(huán)境安全。采集中要有菌種傳代標(biāo)識(shí)。

            2.菌種的活化:購買的標(biāo)準(zhǔn)菌種必須要求是凍干粉,科研中菌種交流可以為斜面或液體。

            菌種的活化最好是在非選擇性瓊脂培養(yǎng)基上,除非特殊情況或特別推薦,一般不用液體培養(yǎng)基。具體使用培養(yǎng)基的情況如下表,詳細(xì)菌種使用方法見附表:

             方法:①胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA),非選擇性羊血瓊脂,PCA或營養(yǎng)瓊脂,35℃正常環(huán)境培養(yǎng)24-48小時(shí)。②非選擇性羊血瓊脂,35℃正常環(huán)境培養(yǎng)24-48小時(shí)。③巧克力瓊脂平板,35℃5-10%CO2環(huán)境培養(yǎng)24-48小時(shí)。④ CDC厭氧血瓊脂35℃厭氧培養(yǎng)48-72小時(shí);部分專性厭氧菌能需要5-7天,才能充分生長;對(duì)于梭菌,以下新鮮培養(yǎng)基也可選用:營養(yǎng)瓊脂,TSA瓊脂,PCA瓊脂,需培養(yǎng)48-96小時(shí)。⑤沙堡氏葡萄糖Emmons瓊脂25-28℃培養(yǎng)3-7天;也可用PDA瓊脂。⑥巧克力瓊脂平板,35℃微需氧環(huán)境培養(yǎng)48-72小時(shí)。⑦ 改良羅氏瓊脂或Middlebrook瓊脂,35℃5-10%CO2或正常環(huán)境培養(yǎng)7天。⑧ 緩沖活性碳酵母提取物瓊脂,35℃正常環(huán)境培養(yǎng)3-5天。⑨巧克力瓊脂平板,35℃5-10%CO2環(huán)境培養(yǎng)48小時(shí)。⑩ 先用腦心浸出液肉湯或TSB培養(yǎng)基35℃增菌培養(yǎng)18-24小時(shí),再劃線至TSA瓊脂35℃正常環(huán)境培養(yǎng)24-48小時(shí)。11、先接種于MRS肉湯35℃增菌培養(yǎng)24-48小時(shí),再劃線接種至含羊血的哥倫比亞CNA培養(yǎng)基35℃5%CO2環(huán)境培養(yǎng)24-48小時(shí)。12、 PDA瓊脂45℃正常環(huán)境培養(yǎng)48-72小時(shí)。13、 先接種于10B精氨酸肉湯,作系列梯度稀釋35℃正常培養(yǎng)至培養(yǎng)基變成粉紅色,接入A-8瓊脂。

            3.菌種保存。所有菌種均由實(shí)驗(yàn)室專人(雙人雙鎖)保存于專用冰箱或其它保存方式。要建立菌種登記臺(tái)帳,詳細(xì)記錄菌種采集、保管、制備、使用、處置情況;每一種菌種一定要有本公司的檢測(cè)鑒定報(bào)告(具體的的鑒定方法見ATCC提供的菌種證書方法);具體菌種保存方法如下:

            3.1 干粉菌種:購買的干粉菌種保存于2-8℃冰箱中,可保存3-5年。

            3.2 斜面菌種或液體菌種:

            3.2.1 液氮罐保存方法:用于第一代菌種的長期保存,每種菌種保存5管。

           ?。?)準(zhǔn)備用于液氮保藏的安瓿管或菌種保存管(塑料),要求能耐受溫度突然變化而不致破裂,因此,需要采用硼硅酸鹽玻璃制造的安瓿管,安瓿管的大小通常使用75×10mm的,或能容1.2mm液體的。

           ?。?)加保護(hù)劑與滅菌保存細(xì)菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的細(xì)胞時(shí),則將空安瓿管塞上棉塞, 121℃滅菌15分鐘:若作保存霉菌菌絲體用則需在安瓿管內(nèi)預(yù)先加入保護(hù)劑如10%的甘油蒸餾水溶液或10%二甲亞砜蒸餾水溶液,加入量以能浸沒以后加入的菌落圓塊為限,而后再用121℃滅菌15分鐘。

           ?。?)接入菌種:將菌種用10%的甘油蒸餾水溶液制成菌懸液,裝入已滅菌的安瓿管;霉菌菌絲體則可用滅菌打孔器,從平板內(nèi)切取菌落圓塊,放入含有保護(hù)劑的安瓿管內(nèi),然后用火焰熔封。浸入水中檢查有無漏洞。

           ?。?)凍結(jié)再將已封口的安瓿管以每分鐘下降1℃的慢速凍結(jié)至-30℃。若細(xì)胞急劇冷凍,則在細(xì)胞內(nèi)會(huì)形成冰的結(jié)晶,因而降低存活率。

            (5)保藏經(jīng)凍結(jié)至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷凍保藏器的小圓筒內(nèi),然后再將小圓筒放入液氮保藏器內(nèi)。液氮保藏器內(nèi)的氣相為-150℃,液態(tài)氮內(nèi)為-196℃。

            (6)恢復(fù)培養(yǎng)保藏的菌種需要用時(shí),將安瓿管取出,立即放入38-40℃的水浴中進(jìn)行急劇解凍,直到全部融化為止。再打開安瓿管,將內(nèi)容物移入適宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

            此法除適宜于一般微生物的保藏外,對(duì)一些用冷凍干燥法都難以保存的微生物如支原體、衣原體、氫細(xì)菌、難以形成孢子的霉菌、噬菌體及動(dòng)物細(xì)胞均可長期保藏,而且性狀不變異。

           3.2.2 液體石蠟保存法:將液體石蠟分裝于三角燒瓶內(nèi),塞上棉塞,并用牛皮紙包扎, 121℃滅菌30分鐘,然后放在40℃溫箱中,使水汽蒸發(fā)掉,備用。將需要保藏的菌種,在最適宜的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng),使得到健壯的菌體或孢子。用滅菌吸管吸取滅菌的液體石蠟,注入已長好菌的斜面上,其用量以高出斜面頂端1cm為準(zhǔn),使菌種與空氣隔絕。將試管直立,置低溫或室溫下保存(有的微生物在室溫下比冰箱中保存的時(shí)間還要長)。

            大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、假單胞桿菌屬、沙門氏菌屬、副傷寒沙門氏菌、李斯特氏菌屬、蠟樣芽胞桿菌、八疊球菌、短芽孢桿菌、大腸桿菌HB101、大腸桿菌DH5a、豬肺疫、禽多殺性巴氏桿菌(禽霍亂)、豬丹毒、大腸桿菌O157、大腸菌群、產(chǎn)氣腸桿菌、志賀氏菌屬;接種于半固體培養(yǎng)基上,36±1℃培養(yǎng)18-24小時(shí),加入無菌石蠟油覆蓋,保存于2-8℃冰箱或室溫中。可保存1-2年。注:副溶血性弧菌接種于含鹽的半固體培養(yǎng)基上,36±1℃培養(yǎng)18-24小時(shí),加入無菌石蠟油覆蓋,保存于室溫

            產(chǎn)氣莢膜梭菌、梭桿菌屬、擬桿菌屬等厭氧菌、厭氧消化鏈球菌:接種于CDC厭氧菌瓊脂中,培養(yǎng)18-24小時(shí),加入無菌石蠟油覆蓋,保存于2-8℃冰箱或室溫中??杀4?-2年。酵母菌:接種于YPD培養(yǎng)基中,28℃培養(yǎng)24-48小時(shí),加入無菌石蠟油覆蓋,保存于2-8℃冰箱或室溫中。可保存1-2年。霉菌、白色念珠球菌:接種于PDA培養(yǎng)基中,28℃培養(yǎng)24-48小時(shí),加入無菌石蠟油覆蓋,保存于2-8℃冰箱或室溫中??杀4?-2年。鏈球菌屬:接種于羊血瓊脂,36±1℃培養(yǎng)24-48小時(shí),加入無菌石蠟油覆蓋,保存于2-8℃冰箱或室溫中??杀4?-2年。副嗜血桿菌、淋病奈瑟菌(需5-10%CO2環(huán)境)、腦膜炎奈瑟菌(需5-10%CO2環(huán)境)、流感嗜血桿菌接種于巧克力瓊脂,36±1℃培養(yǎng)24-48小時(shí),加入無菌石蠟油覆蓋,保存于2-8℃冰箱或室溫中??杀4?-2年。分枝桿菌屬:接種于改良羅氏瓊脂或Middlebrook瓊脂36±1℃培養(yǎng)7天,加入無菌石蠟油覆蓋,保存于2-8℃冰箱或室溫中。可保存1-2年。

            4.菌種制備。菌種制備按照批準(zhǔn)的制備計(jì)劃執(zhí)行。制備中要按規(guī)范要求操作,同時(shí)做好工作記錄。記錄內(nèi)容包括:菌種名稱,傳代標(biāo)識(shí)、制備數(shù)量。在制備容器上作出明確表示。具體菌種制備方法如下:可以麥?zhǔn)媳葷峁苡?jì)數(shù)每ml菌液的菌數(shù)

            1)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、假單胞桿菌屬、沙門氏菌屬、副傷寒沙門氏菌、李斯特氏菌屬、蠟樣芽胞桿菌、八疊球菌、短芽孢桿菌、大腸桿菌HB101、大腸桿菌DH5a、豬肺疫、禽多殺性巴氏桿菌(禽霍亂)、豬丹毒、大腸桿菌O157、大腸菌群、產(chǎn)氣腸桿菌、志賀氏菌屬;把各種細(xì)菌菌種劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板上,36±1℃培養(yǎng)18-24小時(shí),挑取單菌落接種于10ml營養(yǎng)肉湯中,36±1℃培養(yǎng)18-24小時(shí),計(jì)數(shù)出每ml營養(yǎng)肉湯中的細(xì)菌數(shù)。把菌液保存于2-8℃,此菌液可保存7-10天,每10天重新挑取單菌落接種于10ml營養(yǎng)肉湯中, 36±1℃培養(yǎng)18-24小時(shí),用生理鹽水稀釋到10-7,計(jì)數(shù)出10-6/0.1ml、10-7/0.1ml營養(yǎng)肉湯中的細(xì)菌數(shù)。

            2)產(chǎn)氣莢膜梭菌、梭桿菌屬、擬桿菌屬等厭氧菌、厭氧消化鏈球菌等厭氧菌直接接種于10ml液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基中,36±1℃培養(yǎng)18-24小時(shí),計(jì)數(shù)出每ml液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基中的細(xì)菌數(shù)(在厭氧條件下培養(yǎng))。

            3)酵母菌、霉菌和白色念珠球菌:接種于PDA培養(yǎng)基中,28℃培養(yǎng)24-48小時(shí),挑取單菌落接種于10ml葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基中,28℃培養(yǎng)24-48小時(shí),用YPD瓊脂計(jì)數(shù)出每ml葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基中的菌落。把菌液保存于2-8℃,此菌液可保存7-10天,每10天重新挑取單菌落接種于10ml葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基中,28℃培養(yǎng)24-48小時(shí),用生理鹽水稀釋到10-7,計(jì)數(shù)出10-6/0.1ml、10-7/0.1ml葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基中的菌數(shù)。

            4)鏈球菌屬:接種于腦心浸液中36±1℃培養(yǎng)18-24小時(shí),計(jì)數(shù)出每ml腦心浸液中的細(xì)菌數(shù)。把菌液保存于2-8℃,此菌液可保存7-10天,每10天重新挑取單菌落接種于10ml腦心浸液中, 36±1℃培養(yǎng)18-24小時(shí),用生理鹽水稀釋到10-7,計(jì)數(shù)出10-6/0.1ml、10-7/0.1ml腦心浸液中的細(xì)菌數(shù)。

            5)副嗜血桿菌、淋病奈瑟菌(需5-10%CO2環(huán)境)、腦膜炎奈瑟菌(需5-10%CO2環(huán)境)、流感嗜血桿菌接種于巧克力瓊脂,36±1℃培養(yǎng)18-24小時(shí),用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋,經(jīng)比濁后制成每1ml含菌數(shù)約相當(dāng)于100~1000cfu的菌懸液。

            6) 分枝桿菌屬:接種于改良羅氏瓊脂或Middlebrook瓊脂36±1℃培養(yǎng)7天,用0.9%無菌氯化鈉溶液將上述增菌培養(yǎng)后的質(zhì)控菌種的新鮮培養(yǎng)物制成1.0~3.0×103CFU/ml的菌懸液,作為工作菌液。

            5.菌種的標(biāo)識(shí)和使用期限:標(biāo)識(shí):菌種代數(shù)的計(jì)算為干粉菌種為第0代,轉(zhuǎn)接一次斜面加一代。具體標(biāo)識(shí)為:例單增李斯特氏菌ATCC19114第0代,表識(shí)為單增李斯特氏菌ATCC19114-0,第一代表識(shí)為單增李斯特氏菌ATCC19114-1;第一代有12支,則表識(shí)為單增李斯特氏菌ATCC19114-1-1、……、單增李斯特氏菌ATCC19114-1-12;使用期限:傳代次數(shù)不得超過5代,菌種已變異或生化鑒定不符合;

            6.菌種使用。菌種管理員,每月領(lǐng)取1支第一代(或第二代、第三代)菌種。再根據(jù)以上方法制備工作菌液,分發(fā)給實(shí)際使用者,實(shí)際使用者領(lǐng)用前應(yīng)充分考慮重復(fù)實(shí)驗(yàn)的需要。同一實(shí)驗(yàn)要選擇同代菌種,保證實(shí)驗(yàn)的可比性。領(lǐng)用菌種要詳細(xì)登記,領(lǐng)用人要簽字,并注明領(lǐng)用時(shí)間。

            7.菌種處理。實(shí)驗(yàn)完畢的菌種遺留物和污染物應(yīng)嚴(yán)格按照三廢處理規(guī)定執(zhí)行。提供給外部的菌種必須經(jīng)公司總經(jīng)理批準(zhǔn),按規(guī)定要求包裝運(yùn)輸。嚴(yán)禁私自對(duì)外提供菌種。

                                                                                                                                                    本篇轉(zhuǎn)載至實(shí)驗(yàn)之家

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