H9 人胚胎干細胞/STR鑒定（無飼養(yǎng)層）特性

1） 來源：人胚胎干細胞

2） 形態(tài)：貼壁，呈克隆狀

3） 含量：>1x10⁶ 個/mL
4） 污染：支原體、細菌、酵母和真菌檢測為陰性
5） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

運輸和保存

可選擇干冰運輸及發(fā)送復(fù)蘇存活細胞方式

（1）干冰運輸，收到后立即轉(zhuǎn)入液氮或者-80度冰箱凍存或直接復(fù)蘇；

（2）存活細胞，收到后應(yīng)繼續(xù)生長，傳代達到細胞生長狀態(tài)良好時，再進行凍存。具體操作見細胞培養(yǎng)步驟。

（3）收到細胞后請拍照，3天內(nèi)如果發(fā)現(xiàn)污染，請及時拍照與我們聯(lián)系。
 
細胞用途：僅供科研使用。
                       
細胞接收后的處理：
1） 收到細胞后，請檢查是否漏液，如果漏液，請拍照片發(fā)給我們。
2） 請先在顯微鏡下確認細胞生長狀態(tài)，酒精消毒瓶壁并將T25瓶置于37℃培養(yǎng)約2-3h。
3） 將T25瓶中的細胞培養(yǎng)基離心后，去上清，添加6ml*培養(yǎng)基，加入新的T25瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。
4)   如果細胞長滿80%請及時進行細胞傳代.
 H9 人胚胎干細胞（無飼養(yǎng)層）/STR鑒定

用 mTeSR1 培養(yǎng)人胚胎干細胞（hESC）和人 iPS 細胞（hiPS）

1. 試劑和材料

mTeSRTM1 培養(yǎng)基試劑盒（產(chǎn)品號#85850）包括：

所需的其他試劑和材料

2. 試劑的制備

2.1 mTeSR1 的制備
2.1.1 在室溫 (15 - 25°C) 下或冰箱內(nèi) (2 - 8°C) 過夜解凍 mTeSR
™1 5X 添加物（成分編號 #05852）。 如需要，可在無菌條件下將 5X 添加物分裝為適量的工作等份，并在 -20°C 下凍存。冷凍的分量須在 3 個月內(nèi)用完。解凍后的分量應(yīng)在 1 天內(nèi)制備成*的 mTeSR™1 培養(yǎng)基。請勿在解凍后再次冷凍。
2.1.2 在無菌條件下將 100 mL 的 5X 添加物全部解凍后加入到 400 mL 的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，形成總共 500 mL 的容量。充分混勻。*的 mTeSR™1 培養(yǎng)基 在(2 - 8°C) 下儲存時可維持穩(wěn)定狀態(tài)多 2 周，或在-20°C 下冷凍時可維持穩(wěn)定狀態(tài)多 6 個月。在室溫(15 - 25°C) 下或冰箱內(nèi)(2 - 8°C) 過夜解凍冷凍的培養(yǎng)基，不要長時間放在 37°C 水浴內(nèi)加熱培養(yǎng)液。
如果在無菌條件下制備，*的 mTeSR™1 培養(yǎng)基可直接使用，但如需要， 也可使用 0.2 µm 的低蛋白結(jié)合過濾器過濾培養(yǎng)基。

2.2 Matrigel 工作液配制和包被

應(yīng)分裝和冷凍保存 BD Matrigel™ hESC-qualified matrix（BD 產(chǎn)品號
#354277）。有關(guān)分裝的完整說明和建議，請查閱與 BD Matrigel™ 同時提供的產(chǎn)品說明書。分裝后的小包裝可在-70°C 下多儲存 6 個月。
將一份BD Matrigel™ 加入到25 mL 的DMEM/F12 中，這足以包被四個6 孔培養(yǎng)板（1 mL／孔）或三個 100 mm 培養(yǎng)皿（8 mL／培養(yǎng)皿）。
（1） 將 25 mL 的稀釋培養(yǎng)基（DMEM/F12；產(chǎn)品號#11330 ）分裝入離心管放在冰上。
（2） 將一份分裝后的 BD Matrigel™自-70°C 取出 ，在冰上解凍，直到成為液體，然后將解凍后的 BD Matrigel™ 加入到冷稀釋培養(yǎng)基（在 50
mL 的試管中）中，充分混勻。如需要，可用冷培養(yǎng)基沖洗 EP 管。
（3） 立即用稀釋后的 BD Matrigel™ 溶液包被組織培養(yǎng)板。對于 6 孔培養(yǎng)板，每個孔使用 1 mL 稀釋后的 BD Matrigel™；對于 100 mm 培養(yǎng)板， 每個培養(yǎng)板使用 8 mL 稀釋后的 BD Matrigel™。旋動培養(yǎng)板，以使 BD
Matrigel™ 溶液均勻地分布在表面上。
要包被其他尺寸的組織培養(yǎng)皿，則按照需要包被的培養(yǎng)皿的表面積決定稀釋后的 BD Matrigel™用量。
（4） 使用前，包被的培養(yǎng)板應(yīng)放在培養(yǎng)箱(37°C) 下至少 1 個小時。請勿讓培養(yǎng)板脫水。在培養(yǎng)板可供使用之前，請勿移除 BD Matrigel™ 溶液。
如果不立即使用，培養(yǎng)板必須密封，以防止脫水（如利用 Parafilm®）。包被后的培養(yǎng)板可在 2 - 8°C 下多儲存 7 天。
如果 BD Matrigel™溶液并未*覆蓋表面，則無法實現(xiàn)*的 hPSC 培養(yǎng)；因此，不建議使用含有溶液已蒸發(fā)區(qū)域的培養(yǎng)板。
（5） 輕輕地將培養(yǎng)板向一個角落傾斜，使過剩的 BD Matrigel ™ 溶液匯聚在那個角落。用一次性移液管或通過抽取移除溶液。確保移液槍頭不刮到已包被的表面。立即加入 mTeSR™1 培養(yǎng)基和細胞。
如果已將培養(yǎng)板在 2 - 8°C 下儲存，則在移除 BD Matrigel™溶液之前， 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱 (37°C) 下放置 30 分鐘。

2.3 配制 Y27632 溶液

Y27632 粉末溶解在 DPBS 中，配成濃度為 10mM 的儲存液，0.22um 濾膜過濾除菌。分裝后冷凍于-20°C，6 個月內(nèi)使用。
Y27632 提高復(fù)蘇和傳代后的克隆形成率，所以只在復(fù)蘇步驟和傳代步驟添加，換液時不添加 。
 

3. 解凍復(fù)蘇 hES /hiPS

在開始操作程序之前，將所有試管、加熱后的培養(yǎng)基和培養(yǎng)板準備好，以確保盡快完成解凍程序。
（1） 快速在 37°C 水浴槽中解凍 hPSC，方法是輕柔持續(xù)地搖動冷凍管，直到

只剩下一個小冷凍團。從水浴槽中取出冷凍管，用 70% 乙醇擦拭，以進行消毒。
（2） 使用一個 1 mL 的移液管將冷凍管中的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至一個 15 mL 錐形試管中, 過程必須輕柔防止吹散細胞團。
（3） 將 5 - 7 mL 溫暖的 mTeSR™1 逐滴加入試管中，在加入培養(yǎng)基的同時輕柔混勻。
（4） 在室溫(15 - 25°C) 下，以 300 x g 離心細胞 5 分鐘。
（5） 吸出培養(yǎng)基，使細胞團保持完整。使用一個 1 mL 的移液管，輕輕地將細胞重新懸浮在 1 - 2 mL 的 mTeSR™1 中，確保維持細胞的團塊狀態(tài)。根據(jù)終培養(yǎng)細胞的液體體積，加入 ROCK inhibitor Y27632, 終濃度為 10uM
（6） 輕輕地將培養(yǎng)板/皿向一個角落傾斜，使過剩的 BD Matrigel™ 溶液匯聚在那個角落，從而從已包被的組織培養(yǎng)板中移除 BD Matrigel™。使用一次性移液管或通過抽取移除溶液。確保移液槍頭不刮到已包被的表面。
如果已將培養(yǎng)板在 2 - 8°C 下儲存，則在移除 BD Matrigel™溶液之前，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱 (37°C) 下 放置 30 分鐘。
（7） 將含有細胞聚集體的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至 BD Matrigel™ 包被的培養(yǎng)器皿上。一般一支凍存管細胞復(fù)蘇到一個 T25 培養(yǎng)瓶或 6 孔板中的 2 個孔。
（8） 將培養(yǎng)板放在 37°C 培養(yǎng)箱中，然后快速地左右、前后移動培養(yǎng)板，以均勻地將細胞團分布在各個孔內(nèi)。在 37°C、5% CO2 和 95% 濕度的條件下培養(yǎng)細胞。
（9） 每天更換培養(yǎng)基(不需要再添加 Y27632)。在解凍后大約 5 - 7 天內(nèi)檢查可進行傳代的未分化集落（有密集的中心）。
如果在解凍后僅觀察到很少的未分化集落，則可能需要只選擇這些集落進行傳代，并將它們重新放在新的 BD Matrigel™包被的培養(yǎng)板大小相同的孔中。
（10） 每天換液。
 

4. 用 mTeSR1 對 hES/hiPS 進行傳代

在 mTeSR™1 中生長的細胞當集落變得較大、中心變得密集和明亮（對比其邊緣）而相鄰的集落開始融合時，這時可進行傳代。根據(jù)接種的細胞團的大小和密度，傳代周期為 5 天左右。如果太早對集落進行傳代或傳代太過頻繁，則細胞可能吸附不好、產(chǎn)量將會減少且細
胞可能分化。如果太晚對集落進行傳代，培養(yǎng)物將開始顯示分化跡象（特點是細胞類型出現(xiàn)不同的形態(tài)）。
（1） 分裝足夠的 mTeSR™1 以傳代細胞。將分裝的 mTeSR™1、溫和分離液（產(chǎn)品號#07174）和 DMEM/F-12 加熱至室溫( 25°C 左右)。
（2） 使用顯微鏡觀察確定分化的區(qū)域。用氈制粗頭筆或透鏡標志器在培養(yǎng)板底部標記這些區(qū)域。如果培養(yǎng)物品質(zhì)優(yōu)異，分化的區(qū)域不會超過培養(yǎng)孔的 20%。
（3） 用移液槍頭刮除或抽取，去除分化區(qū)域。
（4） 從 hPSC 培養(yǎng)物中吸出培養(yǎng)基，然后用 DPBS（不含鈣鎂離子）沖洗。
（5） 向每個培養(yǎng)瓶內(nèi)加入溫和分離液(每個 T25 加 3ml)，覆蓋底面，在室溫下靜置 1 分鐘。

（6） 吸掉溫和分離液，然后用 6ml DMEM/F-12 輕輕的洗滌培養(yǎng)皿一次。
（7） 向培養(yǎng)瓶內(nèi)加適量 mTeSR™1，并用細胞刮（如 Corning 產(chǎn)品號#3010）將細胞集落刮離培養(yǎng)瓶底。
（8） 將分離的細胞聚集體轉(zhuǎn)移至一個 15 mL 錐形試管中，并加入適量 mTeSR
™1 沖洗培養(yǎng)瓶，以收集殘留的細胞聚集體。將沖洗液一并收集到 15 mL 離心管內(nèi)。
輕輕吹打細胞聚集體 2-3 次，調(diào)整培養(yǎng)基的體積，以實現(xiàn)適當?shù)姆峙?。根?jù)終培養(yǎng)細胞的液體體積，加入 ROCK inhibitor Y27632, 終濃度為 10uM。
（9） 將細胞聚集體與 mTeSR™1 接種至新的 BD Matrigel™ 包被的培養(yǎng)板上。一般傳代周期為 5 天左右，傳代比例為 1：3-1：6。如果集落過于密集或過于稀疏，則下一次傳代時相應(yīng)地調(diào)整傳代比例。請注意，這些指導(dǎo)基于中科院干細胞庫 hESC H1 和 H9 以及 hiPS DYR0100 和 DYP0530 細胞系的生長特征，在其他不同的細胞系和實驗室之間可能會存在差異。
（10） 快速前后和左右多次移動培養(yǎng)板，以使細胞分散在各個孔的表面。將培養(yǎng)板放在 37°C 培養(yǎng)箱中。確保新接種的集落均勻地分布在 BD Matrigel
™包被的培養(yǎng)板的整個表面。細胞團分布不均勻有可能導(dǎo)致 細胞分化。
（11） 每天換液。

5. 冷凍 hESC 或 hiPS 細胞

（1） 用顯微鏡觀察需要凍存的培養(yǎng)物，確定已分化的區(qū)域。用氈制粗頭筆或透鏡標志器在培養(yǎng)板底部標記這些區(qū)域。
如果培養(yǎng)物品質(zhì)優(yōu)異，分化的區(qū)域不會超過培養(yǎng)孔的 20%。
（2） 用移液槍頭刮除或抽取，去除分化區(qū)域。
（3） 從培養(yǎng)孔中吸出殘留的培養(yǎng)基，然后用 DPBS（不含鈣鎂離子）沖洗。
（4） 向每個培養(yǎng)瓶內(nèi)加入溫和分離液(每個 T25 加 3ml)，覆蓋底面，在室溫下靜置 1 分鐘。
（5） 吸掉溫和分離液，然后用 6ml DMEM/F-12 輕輕的洗滌培養(yǎng)皿一次。
（6） 向培養(yǎng)瓶內(nèi)每個孔內(nèi)加適量 mTeSR™1，并用細胞刮（如 Corning 產(chǎn)品號
#3010）將細胞集落刮離培養(yǎng)瓶底。
（7） 將分離的細胞聚集體轉(zhuǎn)移至一個 15 mL 錐形試管中，并加入適量 mTeSR™1 沖洗培養(yǎng)瓶，以收集殘留的細胞聚集體。將沖洗液一并收集到 15 mL 離心管內(nèi)。小心地盡量將細胞團保持到大。
（8） 在室溫(15- 25°C) 下，以 300 x g 離心裝有細胞聚集體的 15 mL 離心管
5 分鐘。離心細胞時，準備和標記凍存管。
（9） 輕輕地吸出上清液，小心保持細胞團完整。
（10） 使用預(yù)冷的(2 -8°C) CryoStor™CS10 輕輕地重新懸浮細胞團，然后將細胞懸液轉(zhuǎn)移至冷凍管中。
（11） 將冷凍管置于程序降溫盒內(nèi)（大約-1°C /min）-80°C 冷凍細胞過夜， 然后轉(zhuǎn)移至液氮長期儲存。

鏡像綺點（上海）細胞技術(shù)有限公司主要產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù)：

一、原代細胞服務(wù)
       各類模式哺乳動物的多種原代細胞資源；
       多種人源性正常及腫瘤原代細胞資源；
       原代細胞分離和培養(yǎng)相關(guān)試劑、kit、培養(yǎng)基添加劑等；
       原代細胞相關(guān)技術(shù)服務(wù)和整體實驗外包服務(wù)；

二、細胞株/系服務(wù)
       細胞株/系培養(yǎng)、增殖、凍存和相關(guān)說明書；
       細胞系培養(yǎng)過程的技術(shù)指導(dǎo)；
       細胞系培養(yǎng)基、添加劑、血清及相關(guān)生長因子、試劑等；

三、iPS細胞
       iPS細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)（有滋養(yǎng)層or無滋養(yǎng)層在）；
       iPS細胞增殖及冷凍保存；
       iPS基礎(chǔ)培養(yǎng)技術(shù)實習；
       新藥及實驗儀器上市前評估；

四、技術(shù)外包服務(wù)：各類細胞生物學實驗、分子生物學實驗、顯微鏡拍照服務(wù)等

五、其他：根據(jù)客戶需要定制服務(wù)等