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核酸檢測PCR實驗室的建設要點有哪些？
疫情暴發(fā)以后，國家對生物安全問題的重視程度越來越高，目前，生物安全已經上升到國家高度，其已納入體系，系統(tǒng)規(guī)劃國家生物安全風險防控和治理體系建設，全面提高國家生物安全治理能力迫在眉睫。2020年10月17日《中華人民共和國生物安全法》正式發(fā)布，自2021年4月15日起施行，其中對于病原微生物實驗室生物安全做出了詳細的規(guī)定。
醫(yī)院諸多實驗室活動會涉及到生物安全問題，尤其是針對病毒核酸檢測活動，基本上為目前生物安全要求高的診斷工作。生物安全對醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)的重要性可見一斑，因此，為進一步加強醫(yī)院實驗室生物安全管理工作，2020年10月16日國家衛(wèi)健委開始牽頭組織修訂《病原微生物實驗室生物安全管理條例》。
一 醫(yī)院實驗室簡介
醫(yī)院很多診斷基于各類實驗進行支持活動，這些實驗活動一般在檢驗科和病理科的醫(yī)學實驗室進行，醫(yī)學實驗室活動如涉及生物安全問題，則必須符合相應等級的生物安全實驗室標準。
WS/T 422-2014《臨床實驗室生物安全指南》將“臨床實驗室”定義為：對取自人體的各種標本進行生物學、微生物學、免疫學、化學、血液免疫學、血液學、生物物理學、細胞學等檢驗，并為臨床提供醫(yī)學檢驗服務的實驗室。
GB/T 22576-2008《醫(yī)學實驗室質量和能力的要求》將“醫(yī)學實驗室”定義為：以為診斷、預防、治療人體疾病或評估人體健康提供信息為目的，對來自人體的材料進行生物學、微生物學、免疫學、化學、血液免疫學、血液學、生物物理學、細胞學、病理學或其他檢驗的實驗室，實驗室可以提供其檢查范圍內的咨詢服務，包括解釋結果和為進一步的適當檢查提供建議。
上述兩個標準的定義對于醫(yī)學實驗室和臨床實驗室基本相同，醫(yī)學實驗室和臨床實驗室為同一種實驗室。
《病原微生物實驗室生物安全管理條例》將“病原微生物實驗室”定義為：從事與病原微生物（能夠使人或者動物致病的微生物）菌（毒）種、樣本有關的研究、教學、檢測、診斷等活動的實驗室。
病原微生物危害程度分類：根據病原微生物的傳染性、感染后對個體或者群體的危害程度，將病原微生物分為四類：
表1 病原微生物的分類
名稱
定義
一類病原微生物
是指能夠引起人類或者動物非常嚴重疾病的微生物，以及我國尚未發(fā)現或者已經宣布消滅的微生物。
第二類病原微生物
是指能夠引起人類或者動物嚴重疾病，比較容易直接或者間接在人與人、動物與人、動物與動物間傳播的微生物。
第三類病原微生物
是指能夠引起人類或者動物疾病，但一般情況下對人、動物或者環(huán)境不構成嚴重危害，傳播風險有限，實驗室感染后很少引起嚴重疾病，并且具備有效治療和預防措施的微生物。
第四類病原微生物
是指在通常情況下不會引起人類或者動物疾病的微生物。
注1：一類、第二類病原微生物統(tǒng)稱為高致病性病原微生物。
醫(yī)院從事病原微生物實驗活動必須在符合相應等級的生物安全實驗室內進行。GB50346-2011《生物安全實驗室建筑技術規(guī)范》將“生物安全實驗室”定義為：通過防護屏障和管理措施，達到生物安全要求的微生物實驗室和動物實驗室。包括主實驗室及其輔助用房。
生物安全實驗室根據所操作致病性生物因子的傳播途徑可分為a類和b類。
表2 生物安全實驗室的分類
名稱
定義
a
指操作非經空氣傳播生物因子的實驗室
b
指操作經空氣傳播生物因子的實驗室
b1
指可有效利用安全隔離裝置進行操作的實驗室
b2
指不能有效利用安全隔離裝置進行操作的實驗室
實驗室生物安全防護水平分級：根據對所操作生物因子采取的防護措施，將實驗室生物安全防護水平分為一級、二級、三級和四級，一級防護水平低，四級防護水平高，依據國家相關規(guī)定。
表3 生物安全實驗室的分類
實驗室簡稱
適用范圍
簡稱
備注
生物安全防護水平為一級的實驗室
適用于操作在通常情況下不會引起人類或者動物疾病的微生物。
P1、BSL-1實驗室
生物安全防護水平為二級的實驗室
適用于操作能夠引起人類或者動物疾病，但一般情況下對人、動物或者環(huán)境不構成嚴重危害，傳播風險有限，實驗室感染后很少引起嚴重疾病，并且具備有效治療和預防措施的微生物。
P2、BSL-2實驗室
P2+、加強型BSL-2實驗室
通過機械通風系統(tǒng)等措施加強實驗室生物安全防護要求的實驗室
生物安全防護水平為三級實驗室
適用于操作能夠引起人類或者動物嚴重疾病，比較容易直接或者間接在人與人、動物與人、動物與動物間傳播的微生物。
P3、BSL-3實驗室
生物安全防護水平為四級實驗室
適用于操作能夠引起人類或者動物非常嚴重疾病的微生物，以及我國尚未發(fā)現或者已經宣布消滅的微生物。
P4、BSL-4實驗室
其中以BSL-1、BSL-2、BSL-3、BSL-4表示僅從事體外操作的實驗室的相應生物安全防護水平。以ABSL-1（Animal Biosafety Level 1, ABSL-1）、ABSL-2、ABSL-3、ABSL-4表示包括從事動物活體操作的實驗室的相應生物安全防護水平。
二 肺炎核酸檢測PCR實驗室
通常醫(yī)院檢驗科和病理科等科室使用的實驗室為生物安全二級（BSL-2）實驗室。但病毒核酸檢測用PCR實驗室則不同，《醫(yī)療機構發(fā)熱門診臨床實驗室能力建設專家共識（2020 版）》說明：對于用于病毒檢測的PCR實驗室（以下簡稱“PCR實驗室”）選址宜設置在發(fā)熱門診內，且建筑標準宜滿足加強型醫(yī)學BSL-2實驗室標準。
《醫(yī)學生物安全二級實驗室建筑技術標準》T/CECS 662-2020則對加強型醫(yī)學BSL-2實驗室建筑技術要求進行了規(guī)定?！夺t(yī)療機構臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則》對PCR實驗室布局和流程進行了明確規(guī)定。
《關于印發(fā)醫(yī)療衛(wèi)生機構檢驗實驗室建筑技術導則（試行）的通知》則對檢驗實驗室建筑技術做出了整體要求。下面結合上述四部規(guī)范相關要求和實際建設的PCR實驗室案例對建設要點進行梳理。
1 PCR實驗室應合理選址和布局
《醫(yī)療機構發(fā)熱門診臨床實驗室能力建設專家共識（2020 版）》要求，對于用于病毒檢測的PCR實驗室應設置在檢驗科中心實驗室和急診實驗室以外的區(qū)域，宜在發(fā)熱門診區(qū)域內，同時，應自成一區(qū)，宜設置在建筑的一端。
實驗室防護區(qū)應包括主實驗室、緩沖間更換間等，輔助工作區(qū)應包括清潔衣物更換間、淋浴間等。
PCR實驗室平面布局一般可分為 “四區(qū)”，即試劑準備區(qū)、樣本制備區(qū)、核酸擴增區(qū)和產物分析區(qū)。結合實際，可采用集中布置或分散布置形式，并配套設置洗消設施。
當采用實時熒光定量PCR儀時，核酸擴增區(qū)和產物分析區(qū)可合并為一區(qū)。當采用一體化自動化核酸分析設備時，樣本制備區(qū)、核酸擴增區(qū)和產物分析區(qū)可合并為一區(qū)。
《病毒肺炎實驗室檢測技術指南（第四版）》指出，病毒核酸檢測方法主要是實時熒光RT-PCR方法，所以用于病毒檢測的PCR實驗室可以設置為 “三區(qū)”。
圖1 “三區(qū)”的PCR實驗室
2 PCR實驗室應合理規(guī)劃檢驗人員
動線、標本動線和污物動線
PCR實驗室標本制備室的生物安全要求高，檢驗人員進入該區(qū)域緩沖間前需要在更衣室穿護服，實驗結束后在緩沖間脫掉護服，因此需要設置更衣室和合理規(guī)劃進出實驗室動線。
為提高效率，咽拭子標本宜設置可直接進入標本制備室的運輸動線，同時標本傳遞口應設置傳遞窗。
根據《病毒感染的肺炎疫情醫(yī)療廢物應急處置管理與技術指南（試行）》要求，有條件的醫(yī)療衛(wèi)生機構可對肺炎疫情防治過程產生的感染性醫(yī)療廢物的暫時貯存場所實行專場存放、專人管理，不與其他醫(yī)療廢物和生活垃圾混放、混裝。
因此，針對標本制備室高壓滅菌消毒后的污物，應規(guī)劃污物運輸動線和相對獨立的暫存間。
圖2 PCR實驗室平面圖（布局、分區(qū)和動線）
3 PCR實驗室氣流組織應符合定向氣流原則
氣流組織應有利于室內氣流由被污染風險低的空間向被污染風險高的空間流動，大限度減少室內回流與渦流。通風空調系統(tǒng)應保證各工作區(qū)的空氣不產生交叉污染。
實驗室的空氣流向可按照試劑儲存和準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增區(qū)→擴增產物分析區(qū)進行，防止擴增產物順空氣氣流進入擴增前的區(qū)域。
圖3 PCR實驗室平面圖（風險區(qū)域劃分）
4 試劑準備區(qū)為正壓
試劑準備區(qū)主要進行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。因此，該區(qū)并不產生污染源，但須確保試劑免受外界污染，該區(qū)相對緩沖間和標本制備室應設置為正壓。
5 標準制備區(qū)要保持負壓
標本制備區(qū)為實驗室核心工作區(qū)，其主要進行的操作為臨床標本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定RNA時cDNA的合成。取樣時病毒還未滅活，且在取樣操作時，容易造成氣溶膠擴散。
《病毒肺炎防控方案（第七版）》指出，病毒的主要傳播途徑為經呼吸道飛沫和接觸傳播，在相對封閉的環(huán)境中長時間暴露于高濃度氣溶膠情況下存在經氣溶膠傳播的可能。
因此，為保護人員安全，必須在生物安全柜內操作，防止標本氣溶膠的擴散。此后，標本經過滅活處理，使病毒蛋白不再有生理活性，失去感染、致病和繁殖能力，使操作人員在對樣本進行檢測時相對安全，但是病毒蛋白的基因序列并沒有受到影響。
因此，后續(xù)操作時主要防止含有病毒核算的氣溶膠污染造成“假陽性”現象。因此，該區(qū)會產生污染源物，該區(qū)對緩沖間和試劑準備室保持負壓，負壓值小于擴增分析室。
6 擴增分析區(qū)負壓值高
擴增分析區(qū)主要進行的操作為DNA或cDNA擴增和擴增片段的測定。操作過程中，要防止含病毒核酸的氣溶膠通過開門卷吸等途徑，擴散出去對試劑與標本造成污染，造成“假陽性”現象。所以擴增分析區(qū)對緩沖間和標本制備室應設置保持負壓，且該區(qū)為實驗室負壓大的房間。
7 關于通風系統(tǒng)的設置
對于標本制備室采用的生物安全柜宜設置ⅡA2型生物安全柜，在生物安全柜操作面或其他有氣溶膠操作地點的上方附近不應設送風口，不宜設置可開啟門的正對面方向。
機械通風系統(tǒng)時應避免交叉污染，排風機應設置在排風管路末端，排風應設置高效過濾器，并通過獨立于建筑物其他公共通風系統(tǒng)的管道排出。
PCR實驗室宜采用全新風直流式空調通風系統(tǒng)，可降低空調系統(tǒng)“藏毒”風險。各區(qū)工作間不應設置可開啟外窗，入口應設置緩沖間,當緩沖間的門設置互鎖時,應在互鎖門的附近設置緊急手動解除互鎖開關。應在合適位置設測壓孔，并采用密封措施。在入口處宜安裝空氣壓力顯示裝置，量程應與實驗室靜壓差相匹配。可設置自動報警功能。
表4 加強型醫(yī)學BSL-2標準PCR實驗室主要技術要求和指標
技術要求
指標
通風方式
機械通風，不應自然通風；且不宜使用循環(huán)風
緩沖間
應設置
核心工作間相對于相鄰區(qū)域小負壓（Pa）
不宜小于-10Pa
高效過濾排風
有
高效過濾送風
宜設置
溫度（℃）
18～26
相對濕度（%）
30～70
噪聲[DB(A)]
≤60
核心工作間平均照度[lx]
≥300
PCR實驗室應保證用電的可靠性，用電負荷等級、自動恢復供電時間的確定應符合現行標準規(guī)定。離心機電源宜與重要儀器設備分開接線。重要儀器設備應配備不間斷電源，當設置不間斷電源（UPS）時，工作時間不宜小于30min。標本制備區(qū)或者消毒間內需配備壓力蒸汽滅菌器以及其他適用的消毒設備，用于穿過的護服和用過的咽拭子樣本瓶等污染物品消毒，因此設計時應預留大功率電源。設置紫外線消毒燈具時，燈具距地1.8～2.2m,控制開關應設置在消毒區(qū)域之外，控制開關的面板形式或顏色宜區(qū)別于普通照明開關，安裝高度宜距地1.8m以上，防止誤操作。
PCR實驗室應設置緊急噴淋裝置和洗眼裝置。每個房間的出口處均應設置非手動開關的洗手池（如腳踏式或感應式），給水管不應與衛(wèi)生器具、實驗設備直接連接，應設置空氣隔斷或倒流防止器，并為后期檢修、更換預留條件。