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新手指南：ELISA的技術要點
閱讀：158 發(fā)布時間：2018-7-11
ELISA 的技術要點包括三個方面：試劑的制備、反應條件的選擇和操作的標準化。
一、試劑的制備
ELISA 的主要試劑為固相的抗原或抗體、酶標記的抗原或抗體和與標記酶直接關聯(lián)的酶反應底物。以下敘述這些試劑的原料和制備方法。
（一）固相載體
可作 ELISA 中載體的物質(zhì)很多，常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后保留原來的免疫活性。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式。在 ELISA 測定過程中，它作為載體和容器，不參與化學反應。加之它的價格低廉，所以被普遍采用。
ELISA 載體的形狀主要有三種：小試管、小珠和微量反應板。小試管的特點是還能兼作反應的容器，后放入分光光度計中比色。小珠一般為直徑 0.6 cm 的圓球，表面經(jīng)磨砂處理后吸附面積大增加。如用特殊的洗滌器，在洗滌過程中使圓珠滾動淋洗，效果更好。常用的載體為微量反應板，于 ELISA 測定的產(chǎn)品也稱為 ELISA 板，通用的標準板形是 8×12 的 96 孔式。為便于作少量標本的檢測，有制成 8 聯(lián)或 12 聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標準 ELISA 板相同。ELISA 板的特點是可以同時進行大量標本的檢測，并可在特定的比色計上迅速讀出結(jié)果?，F(xiàn)在已有多種自動化儀器用于微量反應板型的 ELISA 檢測，包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟，對操作的標準化極為有利。
良好的 ELISA 板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間和同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯 ELISA 板由于配料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大。因此每一批號的聚苯乙烯制品在使用前須檢查其性能。常用的檢查方法為：以一定濃度的人 IgG（一般為 10ng/ml）包被 ELISA 板各孔后，每孔內(nèi)加入適當稀釋的酶標抗人 IgG 抗人 IgG 抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應后分別測每孔溶液的吸光度。控制反應條件，使各讀數(shù)在 0.8 左右。計算所有讀數(shù)的平均值。所有單個讀數(shù)與平均讀數(shù)之差應小于 10％。
與聚苯乙烯類似的塑料為聚氯乙烯。作為 ELISA 固相載體，聚氯乙烯板的特點為質(zhì)軟板薄，可切割，價廉、但光潔度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有時也略高。
為比較不同固相在某一 ELISA 測定中的優(yōu)劣，可用以下方法加以檢驗：用其它免疫學測定方法選出一個典型的陽性標本和一個典型的陰性標本。將它們分別進行一系列稀釋后，在不同的固相載體上按預定的 ELISA 操作步驟進行測定，然后比較測定結(jié)果。在哪一種載體上陽性結(jié)果與陰性結(jié)果判別大，這種載體就是這一 ELISA 測定的合適的固相載體。
除塑料制品外，固相酶免疫測定的載體還有兩種材料：一是微孔濾膜，如硝酸纖維素膜、尼龍膜等，這類測定形式將在本章第五節(jié)「膜載體的酶免疫測定」中介紹。另一種載體是以含鐵的磁性微粒制作的，反應時固相微粒懸浮在溶液中，具有液相反應的速率，反應結(jié)束后用磁鐵吸引作為分離的手段，洗滌也十分方便，但需配備特殊的儀器。
（二）抗原和抗體
在 ELISA 實施過程中，抗原和抗體的質(zhì)量是實驗是否成功的關鍵因素。本法要求所用抗原純度高，抗體效價高、親和力強。
ELISA 所用抗原有三個來源：天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原。天然抗原取材于動物組織或體液、微生物培養(yǎng)物等，一般含有多種抗原成分，需經(jīng)純化，提取出特定的抗原成分后才可應用，因此也稱提純抗原（purifiedantigen）。重組抗原（recombinantantigen）和多肽抗原（peptideantigen）均為人工合成品，使用安全，而且純度高，干擾物質(zhì)少。因此雖然制備合成抗原有較高的技術難度且要求較為昂貴的儀器設備和試劑，其應用仍十分普遍，特別是對那些天然抗原不易得到的試驗，更顯出其獨到之處。
用于 ELISA 的抗體有多克隆的和單克隆的?？寡宄煞謴碗s，應從中提取 IgG 才可用于包被固相或酶標記。含單克隆抗體的小鼠腹水中的特異性抗體含量較高，有時可適當稀釋后直接進行包被。制備酶結(jié)合物用的抗體的質(zhì)量往往要求有較高的純度。經(jīng)硫酸銨鹽析純化的 IgG 可進一步用各種分子篩層析提純。也可用親和層析法提純特異性 IgG，如用酶消化 IgG 后提取的 Fab 片段，則效果更好。
（三）免疫吸附劑
固相的抗原或抗體稱為免疫吸附劑。將抗原或抗體固相化的過程稱為包被（coating）。由于載體的不同，包被的方法也不同。如以聚苯乙烯 ELISA 板為載體，通常將抗原或抗體溶于緩沖液（常用的為 pH9.6 的碳酸緩沖液）中，加于 ELISA 板孔中在 4℃ 過夜，經(jīng)清洗后即可應用。如果包被液中的蛋白質(zhì)濃度過低，固相載體表面有能被此蛋白質(zhì)*覆蓋，其后加入的血清標本和酶結(jié)合物中的蛋白質(zhì)也會部分地吸附于固相載體表面，后產(chǎn)生非特異性顯色而導致本底偏高。在這種情況下，如在包被后再用 1％～5％ 牛血清白蛋白包被一次，可以消除這種干擾。這一過程稱為封閉（blocking）。包被好的 ELISA 板在低溫可放置一段時間而不失去其免疫活性。
（四）酶和底物
ELISA 中所用的酶要求純度高、催化反應的轉(zhuǎn)化率高、專一性強、性質(zhì)穩(wěn)定、來源豐富、價格不貴、制備成的酶標抗體或抗原性質(zhì)穩(wěn)定，繼續(xù)保留著它的活性部分和催化能力。好在受檢標本中不存在與標記酶相同的酶。另外它的相應底物應易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定，光吸收高。ELISA 中常用的酶為辣根過氧化酶（HRP）和從牛腸粘膜或大腸桿菌提取的堿性磷酸酶（AP）。
HRP 在蔬菜作物辣根中含量很高，純化方法也不復雜。它是一種糖蛋白，含糖量約 18％；分子量為 44kD；是一種復合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成的一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶為無色糖蛋白，在 275nm 波長處有高吸收峰；輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán)，在 403nm 波長處有高吸收峰。HRP 催化反應：
DH2 + H2O2—— D +2 H2O
上式中 DH2 為供氫體，H2O2O 為受氫體。HRP 對受氫體的專一性很高，除 H2O2 外，僅作用于小分子醇的過氧化物和尿素的過氧化物。后者為固體，作為試劑較 H2O2 方便。許多化合物可作為 HRP 的供氧體，在 ELISA 中常用的供氫體底物為鄰苯二胺（orthopenylenediamine，OPD）、四甲基聯(lián)苯胺（3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine，TMB）和 ABTS[2，2'-azino-bis(3-ethyl-benzthiazolinesulfonate-6)]。
OPD 為在 ELISA 中應用多的底物，靈敏度高，比色方便。其缺點是配成應用液后穩(wěn)定性差，而且具有致異變性。TMB 無此缺點。TMB 經(jīng)酶作用后由無色變藍色，目測對比鮮明；加酸停止酶反應后變黃色，可在比色計中定量；因此應用日見增多。ABTS，雖然靈敏度不如 OPD 和 TMB，但空白值很低。
HRP 的純度用 RZ（ReinheitZahl，意為純度數(shù)）表示，是 403nm 的吸光度與 280nm 的吸光度之比，高純度的 HRP 的 RZ≥3.0。應注意的是酶變性后，RZ 可不變而活力降低，故重用酶制劑時更重要的指標為活力。酶活力以單位表示：1 min 將 1μmol 的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量為 1 個單位。
在 ELISA 中另一常用的酶為堿性磷酸酶。從大腸桿菌提取的 AP 分子量為 80kD，酶作用的適 pH 為 8.0；用小牛腸粘膜提取的 AP 分子量為 100kD，適 pH 為 9.6。一般采用對硝基苯磷酸酯（p-nitrophenylphosphate，p-NPP）作為底物。它可制成片狀試劑，使用方便。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，在 405nm 有吸收峰。用 NaOH 終止酶反應后，黃色可穩(wěn)定一段時間。
在 ELISA 中應用 AP 系統(tǒng)，其敏感性一般高于應用 HRP 系統(tǒng)，空白值也較低。但由于 AP 較難得到高純度制劑，穩(wěn)定性較 HRP 低，價格較 HRP 高，制備酶結(jié)合物時得率較 HRP 低等原因，國內(nèi)在 ELISA 中一般均采用 HRP。
除 HRP 和 AP 以外，在商品 ELISA 試劑中應用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。
β-半乳糖苷酸的底物常用 4-甲基傘基-β-D 半乳糖苷（4-mehtyumbelliferyl-β-D-galactoside），經(jīng)酶水解后產(chǎn)生熒光物質(zhì) 4-甲基傘酮（4-mehtylumbelliferone），可用熒光計檢測。
熒光的放大作用大大提高了方法的敏感度。AP 也可應用可產(chǎn)生熒光的傘基磷酸酯作底物。其缺點是需要熒光計測定，而且如用固相載體直接作為測定容器，此載體不可發(fā)出熒光。脲酶的特點是酶作用后反應液發(fā)生 pH 改變，可使指示劑變色；另外，在人體內(nèi)沒有內(nèi)源酶（酶的化學發(fā)光底物見第十八章）。
（五）結(jié)合物
酶標記的抗原或抗體稱為結(jié)合物（conjugate）?？乖捎诨瘜W結(jié)構(gòu)不同，可用不同的方法與酶結(jié)合。如為蛋白質(zhì)抗原，基本上可參考抗體酶標記的方法。制備抗體酶結(jié)合物的方法通常有以下幾種。
1．戊二醛交聯(lián)法戊二醛是一種雙功能團試劑，可以使酶與蛋白質(zhì)或其他抗原的氨基通過它而偶聯(lián)。戊二醛交聯(lián)可用一步法（如連接 AP），也可用二步法（如連接 HRP）。舉例如下：
2～5 mg 純抗體與 5 mgAP 混合于 0.1mol/LpH6.8 的磷酸緩沖液 1 ml 中，4℃ 下對同上緩沖液透析平衡。磁力攪拌下，緩慢加入 1％ 戊二醛 0.05 ml，在室溫下放置 2 小時。在 4℃ 下對 0.05mol/LpH8.0Tris 緩沖液透析平衡，即得酶標抗體。
辣根過氧化物酶可溶解于 50％ 飽和度硫酸銨中。用上法交聯(lián)后可用 50％ 飽和度硫酸銨沉淀酶標抗體，棄去上清中游離酶。
戊二醛一步法操作簡便、有效，而且重復性好。缺點是交聯(lián)時分子間的比例不嚴格，大小也不一，影響效果。
制備 HRP 抗體結(jié)合物也可用二步法，即先將 HRP 與戊二醛作用，透析除去戊二醛，在 pH9.5 緩沖液中再與抗體作用而形成酶標抗體。此法的效率可高于一步法 10 倍左右。
2．過碘酸鹽氧化法本法只用于 HRP 的交聯(lián)。該酶含 18％ 碳水化合物，過碘酸鹽將其分子表面的多糖氧化為醛基。用硼氫化鈉（NaBH4）中和多余的過碘酸。酶上的醛根很活潑，可與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成摩爾比例結(jié)合的酶標結(jié)合物。有人認為此法為辣根過氧化物酶交聯(lián)有效的方法。但也有只認為由于所用試劑較為劇烈，各批實驗結(jié)果不易重復。
按以上方法制備的結(jié)合物一般混有未結(jié)合的酶和抗體。理論上結(jié)合物中混有游離酶不影響 ELISA 中后的酶活性測定，因經(jīng)過洗滌，非特異性吸附于固相上的游離酶已被洗去。但游離的抗體則會與酶標抗體競爭相應的固相抗原，因而減低結(jié)合到固相上的酶標抗體量。因此制備的結(jié)合物應予以純化。純化的方法較多，分離大分子混合物的方法均可應用。硫酸銨鹽析法操作簡便，但效果不如用 SephadexG-200 凝膠過濾的好。
二、適工作濃度的選擇
在建立某一 ELISA 測定中，應對包被抗原或抗體的濃度和酶標抗原或抗體的濃度予以選擇，以達到合適的測定條件和節(jié)省測定費用。下面以間接法測抗體和夾心法測抗原為例，介紹適工作濃度的選擇方法。
（一）間接法測抗體
1．酶標抗抗體工作濃度的選擇
（1）用 100ng/ml 人 IgG 進行包被，洗滌。
（2）將酶標抗人 IgG 用稀釋液作一系列稀釋后分別加入已包被的孔中，保溫、洗滌。
（3）加底物顯色。加酸終止反應后，讀取吸光度（A），繪制曲線如圖 15-10。讀取 A 值在 1.0 時的酶標抗體稀釋度，作為酶標抗體的工作濃度。該酶標抗人 IgG 的工作濃度應為 1/1600。
2．棋盤滴定法選擇包被抗原工作濃度
（1）用包被液將抗原作一系列稀釋后進行包被，洗滌。
（2）將強陽性參考血清、弱陽性參考血清和陰性參考血清用稀釋液作 1:100 稀釋，加樣，保溫，洗滌。
（3）加按工作濃度稀釋的酶標抗人 IgG 抗體，保溫，洗滌。
（4）加底物顯色。加酸終止反應后讀取 A 值。
（5）選擇強陽性參考血清的 A 值為 0.8 左右、陰性參考血清的 A 值小于 0.1 的包被抗的的稀釋度作為工作濃度。表 15-1 為本例的測定結(jié)果，表中數(shù)字為 A 值。從表中可見 1:200 為舒適的工作濃度。
表 15-1 間接 ELISA 法包被抗原工作濃度的選擇
各類血清 抗原稀釋度
1:50 1:100 1:200 1:400 1:800
強陽性 1.20 1.04 0.84 0.68 0.42
弱陽性 0.64 0.41 0.30 0.22 0.19
陰性 0.23 0.13 0.08 0.66 0.05
稀釋液 0.09 0.02 0.02 0.02 0.04
（二）夾心法測抗原
在夾心法 ELISA 法中可用棋盤滴定法同時選擇包被抗體和酶標抗體的工作濃度，舉例如下：
夾心 ELISA 包被抗體和酶標抗體工作濃度的選擇
包被抗體的濃度及 參考抗原
酶標抗體稀釋度 強陽性（25ng/ml）弱陽性（1.5ng/ml）陰性
10 μg/ml
1:1000 1.17 0.15 0.09
1:5000 0.46 0.03 0
1:25000 0.12 0 0
1 μg/ml
1:1000 ＞2 0. 25 0.10
1:5000 0.91 0.12 0.01
1:25000 0.25 0.01 0
0.1 μg/ml
1:1000 0.42 0.13 0.13
1:5000 0.11 0.03 0.02
1:25000 0.03 0 0
（1）抗體免疫球蛋白用包被緩沖液稀釋至蛋白濃度為 10、1 和 0.1 μg/ml，分別在 ELISA 板上進行包被，每一濃度包括三個縱行，洗滌。
（2）在一個橫行各包被孔中加入強陽性抗原液，另一橫行加入弱陽性抗原液，第三橫行加入陰性對照液，保溫，洗滌。
（3）將酶標抗體用稀釋液稀釋成三個濃度，例如 1:1000、1:5000 和 1:25000。分別加入每一包被濃度的一個縱行中，保溫，洗滌。
（4）加底物顯色。加酸終止反應后，讀取 A 值。
（5）以強陽性抗原的 A 值在 0.8 左右、陰性參考的 A 值小于 0.1 的條件作適條件，據(jù)此選擇包被抗體和酶標抗體的工作濃度。從表 15-2 可看出包被抗體濃度可選用 1 μg/ml，酶標抗體的稀釋度可選為 1:5000。為了進一步節(jié)省試劑，可以此濃度為基點，縮小間距再做進一步的棋盤滴定。
三、測定方法的標準化
要使 ELISA 測定得到準確的結(jié)果，不論是定性的還是定量的，必須嚴格按照規(guī)定的方法制備試劑和實施測定。主要試劑的制備要點已如前述，其他一般性試劑，如包被緩沖液、洗滌液、標本稀釋液、結(jié)合物稀釋液、底物工作液和酶反應終止液等，配制時不可掉以輕心。緩沖液可于冰箱中短期保存，使用前應觀察是否變質(zhì)。蒸餾水的質(zhì)量在 ELISA 中也至關重要，好使用新鮮重蒸餾的。不合格的蒸餾水可使空白值升高。
測定的實施中，應力求各個步驟操作的標準化，下面以板式 ELISA 為例，介紹有關注意事項。
（一）加樣
在 ELISA 中除了包被外，一般需進行 45 加樣。在定性測定中有時不強調(diào)加樣量的準確性，例如規(guī)定為加樣一滴。此時應該使用相同口徑的滴管，保持準確的加樣姿勢，使每滴液體的體積基本相同。在定量測定中則加樣量應力求準確。標本和結(jié)合物的稀釋液應按規(guī)定配制。加樣時應將液體加在孔底，避免加在孔壁上部，并注意不可出現(xiàn)氣泡。
（二）保溫
在 ELISA 中一般有二次抗原抗體反應，即加標本后和加結(jié)合物后，此時反應的溫度和時間應按規(guī)定的要求，保溫容器好是水浴箱，可使溫度迅速平衡。各 ELISA 板不應疊在一起。為避免蒸發(fā)，板上應加蓋，或?qū)迤椒旁诘撞繅|有濕紗布的濕盒中。濕盒應該是金屬的，傳熱容易。如用保溫箱，空濕盒應預先放在其中，以平衡溫度，這在室溫較低時更為重要。加入底物后，反應的時間和溫度通常不做嚴格要求。如室溫高于 20℃，ELISA 板可避光放在實驗臺上，以便不時觀察，待對照管顯色適當時，即可終止酶反應。
（三）洗滌
洗滌在 ELISA 過程中不是反應聚，但卻是決定實驗成敗的關鍵。洗滌的目的是洗去反應液中沒有與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)以及在反應過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯待塑料對蛋白質(zhì)的吸附作用是普遍性的。因此在 ELISA 測定的反應過程中應盡量避免非特異性吸附，而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。在標本和結(jié)合物的稀釋液和洗滌液中加入聚山梨酯（吐溫，Tween）一類物質(zhì)即右達到此目的。聚山梨酯是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，為非離子型的表面張力物質(zhì)，常作為助溶劑。根據(jù)脂肪酸的種類而對聚山梨酯編號，結(jié)合月桂酸的為聚山梨酯 20，在 ELISA 中為常用。它的洗滌效果好，并具有減少非特異性吸附和增強抗原抗體結(jié)合的作用。
洗滌如不*，特別在后一次，如有酶結(jié)合物的非特異性吸附，將使空白值升高。另外，在間接法中如血清標本內(nèi)的非特異性 IgG 吸附在固相上而未被洗凈，也將與酶標抗體作用而產(chǎn)生干擾。
ELISA 板的洗滌一般可采用以下方法：①吸干孔內(nèi)反應液；②將洗滌液注滿板孔；③放置 2 min，略作搖動；④吸干孔內(nèi)液，也可傾去液體后在吸水紙上拍干。洗滌的次數(shù)一般為 3～4 次，有時甚至需洗 5～6 次。
（四）比色
如陰性對照顏色極淺，在定性測定中一般可采用目視比色。如用比色計測定結(jié)果，準確性決定于 ELISA 板底的平整與透明度和比色計的質(zhì)量。