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染色質(zhì)免疫沉淀DNA分析
閱讀：225 發(fā)布時(shí)間：2018-7-19| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 47.9KB |
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實(shí)驗(yàn)步驟
1. 交聯(lián)和細(xì)胞收集
1) 取 2 個(gè) 150 cm2培養(yǎng)皿的融合細(xì)胞（每皿細(xì)胞數(shù)約 1 X 107 - 5 X 107 個(gè)）。向培養(yǎng)基中滴加甲醛以使蛋白和 DNA 相交聯(lián)，甲醛的終濃度為 0.75%（體積百分比），室溫下輕輕搖動(dòng) 10 分鐘。
2) 加入甘氨酸至終濃度為 125 mM，輕輕振蕩孵育 5 分鐘。
3) 用 10 ml 冷 PBS 洗滌細(xì)胞 2 次。
4) 用 5 ml 冷 PBS 刮下細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至一個(gè) 50 ml 離心管中。
5) 用 3 ml PBS 洗滌培養(yǎng)皿，收集剩余細(xì)胞至 50 ml 離心管中。
6) 1000 g 離心 5 分鐘。
7) 小心吸棄上清液，用 FA 裂解緩沖液重懸沉淀（每 1 X 107個(gè)細(xì)胞加 750 μl）。
2. 超聲
1) 將裂解液超聲處理以使DNA斷裂成約 500-1000 bp 的片段。不同的細(xì)胞系需要不同的超聲時(shí)間，因此需分別進(jìn)行優(yōu)化。
2) 超聲處理后，4 °C，8000 g 離心 30 秒使細(xì)胞碎片沉淀。將上清液轉(zhuǎn)移到新管中。此染色質(zhì)溶液將用于步驟 4 的免疫沉淀 (IP)
3) 每個(gè)超聲后的樣本均取 50 μl，此樣本為抽樣樣本，用于定量 DNA 濃度（見(jiàn)步驟 3），并作為 PCR 的對(duì)照樣本。
3. DNA濃度測(cè)定
1) 抽樣樣本用來(lái)測(cè)定 DNA 濃度，為后續(xù) IPs 反應(yīng)提供數(shù)據(jù)。用 PCR 產(chǎn)物純化試劑盒（加 70 μl 洗提緩沖液，轉(zhuǎn)至步驟 3.2a）或酚：（加 350 μl 洗提緩沖液，轉(zhuǎn)至步驟 3.2b）來(lái)純化 DNA。
2) 加入 2 μl RNA 酶 A (0.5 mg/ml)。置于 65 °C 恒溫振蕩 4-5 小時(shí)（或過(guò)夜）以解交聯(lián)。按照 PCR 產(chǎn)物純化試劑盒說(shuō)明書(shū)來(lái)純化DNA。樣本可凍存于 -20 °C 冰箱中。
3) DNA 濃度測(cè)定: 取 5 μl 純化 DNA，加入裝有 995 μl TE 的離心管中，200 倍稀釋，測(cè)定 OD260。根據(jù)公式 DNA 濃度（μg/ml）= OD260 x 10,000，計(jì)算每毫升染色質(zhì)溶液中 DNA 的濃度。
4. 免疫沉淀
1) 使用步驟 2.2 中得到的染色質(zhì)溶液繼續(xù)此操作。建議每個(gè)免疫沉淀反應(yīng) DNA 含量約為 25 μg 。每個(gè)樣本用 RIPA 緩沖液 1:10 稀釋。應(yīng)設(shè)一個(gè)抗體對(duì)照和一個(gè)僅加磁珠的對(duì)照。
2) 除對(duì)照外，其余樣本中均加入一抗。事先應(yīng)通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)得到的抗體加入量。一般來(lái)說(shuō)，每 25 μg DNA 加入 1-10 μg 抗體。
3) 所有樣本均加入 20 μl 的 A/G 蛋白磁珠（預(yù)吸附了單鏈魚(yú)精 DNA 和牛血清白蛋白，見(jiàn)步驟 4.3a），進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)，4 °C 旋轉(zhuǎn)過(guò)夜。
4) A/G 蛋白磁珠與單鏈魚(yú)精 DNA 混合液的制備：如果使用 A 蛋白和 G 蛋白兩種磁珠，應(yīng)將其等體積混合，并用 RIPA 緩沖液洗滌 3 次。吸棄 RIPA 緩沖液，加入單鏈魚(yú)精 DNA 至終濃度 75 ng/μl，同時(shí)加入牛血清白蛋白至終濃度 0.1 μg/μl。加入等體積 RIPA 緩沖液，常溫旋轉(zhuǎn)孵育 30 分鐘。用 RIPA 緩沖液洗滌一次，然后加入等體積 RIPA 緩沖液。
5) 將 A/G 蛋白磁珠離心，2000g 1 分鐘，棄上清。
6) 用 1 ml 洗滌緩沖液洗滌磁珠 3 次。2000g 離心 1 分鐘。
7) 用末次洗滌緩沖液洗 1 次。2000g 離心 1 分鐘。
5. 洗提和解交聯(lián)
1) 洗提 DNA：向 A/G 蛋白磁珠中加入 120 μl 洗提緩沖液，30 °C 旋轉(zhuǎn) 15 分鐘。
2) 2000g 離心 1 分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移至新管中。樣本可于 -20 °C 保存。
3) 純化 DNA 可用 PCR 純化試劑盒（見(jiàn)步驟 3.2a）或酚:（加 280 μl 洗提緩沖液，然后參照步驟 3.2b）法進(jìn)行。
4) DNA 可用實(shí)時(shí) PCR 進(jìn)行定量檢測(cè)?？捎脤?shí)時(shí) PCR 儀自帶的軟件進(jìn)行引物和探針設(shè)計(jì)，或者使用在線設(shè)計(jì)工具進(jìn)行設(shè)計(jì)。