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自然殺傷細胞和淋巴因子激活殺傷細胞的殺傷功能實驗
閱讀：464 發(fā)布時間：2019-3-18NK細胞存在于人或動物外周血、脾臟、淋巴結(jié)和骨髓中，能殺傷某些腫瘤細胞、病毒感染靶細胞，無需抗原或有絲分裂原刺激，亦不依賴抗體或補體，在機體殺傷腫瘤、防御感染及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。（來源：醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)免疫學(xué)實驗指導(dǎo)，主編金伯泉李恩善，第1 版，北京：世界圖書出版社，1990）
實驗方法原理 NK細胞存在于人或動物外周血、脾臟、淋巴結(jié)和骨髓中，能殺傷某些腫瘤細胞、病毒感染靶細胞，無需抗原或有絲分裂原刺激，亦不依賴抗體或補體，在機體殺傷腫瘤、防御感染及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。
LAK是NK或T細胞在體外高劑量IL-2誘導(dǎo)下，獲得能殺傷NK抵抗的腫瘤細胞的功能，在過繼免疫治療腫瘤中已得到廣泛的應(yīng)用。
通過將同位素51Cr摻入到NK的靶細胞K562（紅白細胞白血病細胞）或LAK的靶細胞LiBr（黑色素瘤細胞），按一定細胞比例與效應(yīng)細胞（NK或LAK）孵育4 小時，根據(jù)細胞上清中靶細胞被殺傷后所釋放的51Cr水平計算出殺傷細胞的殺傷活性。
實驗材料 K562LiBr
試劑、試劑盒 3H-TdR51CrFCSRPMI1640rHu IL-2
儀器、耗材 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)板CO2孵箱液閃儀計數(shù)儀
實驗步驟
一、效應(yīng)細胞的制備
NK功能效應(yīng)細胞可取靜止的PBMC，或經(jīng)不同細胞因子誘導(dǎo)的PBMC。
LAK功能的效應(yīng)細胞通常將PBMC或腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）或體液（癌性胸腹水）中純化的淋巴細胞（1×106 /ml）在含有高劑量IL-2（200～1000 μ/ml）的10 ％FCS RPMI1640 誘導(dǎo)2～5 天而成。
二、殺傷試驗
主要有4 h 51Cr釋放法和3H-TdR釋放法，前者要求51Cr質(zhì)量好，同位素半衰期較短，操作所需時間短；后者需要無菌操作，所需時間較長。
1. 51Cr 4 小時釋放試驗
（1）收獲處于對數(shù)生長期的靶細胞（K562，LiBr等）洗滌后調(diào)整細胞濃度為2×106 /ml
（2）取1×106細胞（0.5 ml），加Na251CrO4 100 μci，37 ℃孵育2～3 h，每15 min輕輕振搖一次
（3）用10 ％FCS RPMI1640洗滌3 次，每次800 rpm，5 min
（4）重懸細胞濃度1×105 /ml
（5）96 孔V型或U型培養(yǎng)板中，每孔加100 μl（1×104細胞），每份3 個復(fù)孔
（6）每孔加入100 μl不同細胞濃度的效應(yīng)細胞，大釋放組加入100 μl，1 ％TritonX-100；自然釋放組加100 μl*培養(yǎng)基
（7）200 g 離心1 min，37 ℃、CO2孵箱 4 h，200 g 離心1 min
（8）每孔取出100 μl上清，γ計數(shù)儀上測定cpm值
（9）計算
實驗組cpm-自然釋放cpm
特異性殺傷率（％）＝─────────────
大釋放cpm-自然釋放cpm
2. 3H-TdR釋放試驗
（1）收獲處于對數(shù)生長期的靶細胞（K562、LiBr等）洗滌后調(diào)整細胞濃度為2×106 /ml，加3H-TdR 20 μci
（2）37 ℃孵育2～3 h
（3）用10 ％FCS RPMI1640洗滌3 次，每次800 rpm，5 min 調(diào)整細胞濃度為1×105 /ml
（4）96 孔U型或平底培養(yǎng)板中，每孔加100 μl（1×104細胞），每份3個復(fù)孔
（5）每孔加入100 μl不同細胞濃度的效應(yīng)細胞，大釋放組加100 μl 1％TritonX-100，自然釋放組加100 μl*培養(yǎng)基
（6）CO2孵箱培養(yǎng)18～24 h
（7）每孔吸出100 μl上清，加入胰蛋白酶（終濃度0.15 ％）和DNA酶（終濃度為0.0125 ％）
（8）繼續(xù)孵育30 min
（9）用細胞收集儀收獲于玻璃纖維紙上
（10）干燥后，移入液閃瓶中，加入1 ml閃爍液，β液閃儀中測cpm值
（11）計算
實驗組cpm
特異性釋放率（％）＝(1- ────── )×100％
對照組cpm
收起
注意事項
1. 每次試驗取3～4 個不同效應(yīng)細胞/靶細胞比例，常用效靶比例為100∶1，50∶1，25∶1，12.5∶1。
2. 誘導(dǎo)LAK細胞過程中要注意無菌操作。
3. 避免同位素污染。
4. 根據(jù)實驗需要，可采用純化的NK細胞作為效應(yīng)細胞，用Percoll不連續(xù)密度梯度離心純化NK細胞。
（1）1個溶解單位（Lytic unit，LU）為一定效應(yīng)細胞30 ％溶解（殺傷）5×103靶細胞（K562）的水平。
（2）如需進一步純化LGL，可通過除去具有高親和性羊紅細胞受體細胞（T細胞），因為NK細胞只具有低親和性的綿羊紅細胞受體（ER）。具體方法是將Percoll分離的位于第2梯度的細胞洗滌后調(diào)整細胞濃度為5×106 /ml，移入試管，加入2 mlFCS和2 ml 1×108 /ml SRBC，100 g離心5 min，29 ℃孵育1 h，輕輕重懸細胞，疊加于3 ml Ficoll上，400 g室溫下離心30 min界面不形成花環(huán)的細胞即為LGL，純度可>90％。
（3）在用PBMC作為效應(yīng)細胞進行NK活性測定時，如想除去PBMC懸液中混雜的紅細胞，可用蒸餾水低滲的方法除去紅細胞，而不用NH4Cl方法，因為后者可降低NK功能。
（4）在小鼠NK實驗中必須注意小鼠的品系和周齡，不同小鼠系NK活性有明顯的差別
（5）3周以內(nèi)或超過3個月以上小鼠的NK水平一般很低。