禽流感病毒H5亞型熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒犬副流感病毒（Canine Parainfluenza Virus，CPIV）可以引起犬副流感，這是犬的主要的呼吸道傳染病。臨床表現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、流涕等癥狀。病理變化以卡他性鼻炎和支氣管炎為特征。研究表明，犬副流感病毒也可引起急性腦髓
炎和腦內(nèi)積水，臨床表現(xiàn)后軀麻癖和運(yùn)動(dòng)失調(diào)等癥狀。傳統(tǒng)診斷方法主要有病
毒的分離鑒定、免疫熒光抗體試驗(yàn)、免疫電鏡觀察和 ELISA 等方法。但這些方
法操作過(guò)程繁瑣、操作難度大，所需要時(shí)間較長(zhǎng)，專一性不強(qiáng)因此建立一種快
速、高靈敏度的診斷方法對(duì)防治犬副流感病毒是十分必要的。本產(chǎn)品就是針對(duì)
這一需求開發(fā)的實(shí)時(shí)定量 RT-PCR 產(chǎn)品，

禽流感病毒H5亞型熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒具有下列特點(diǎn)：
1. 靈敏度高，分析靈敏度可以達(dá)到 50 拷貝/uL，遠(yuǎn)高于常規(guī)方法，也比常規(guī)
的 RT-PCR 檢測(cè)高 100 倍。
2. 特異性高，根據(jù) CPIV 的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，不會(huì)誤檢其他豬的病原性病毒
3. 一管封閉式，避免了 RT-PCR 產(chǎn)物對(duì)后續(xù) RT-PCR 的污染。
4. 線性范圍廣，在 10-10
7拷貝/uL 的靶分子濃度范圍內(nèi)均呈線性。
5. 簡(jiǎn)單快捷，只需要 2 小時(shí)即可得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 規(guī)格及成分 成 份 編 號(hào) 十孔盒包裝
即用型熒光 RT-PCR Mix 101219 750 uL
CPIV 專一性引物對(duì)（25uM each） Yw14141415 100 uL
CPIV 陽(yáng)性對(duì)照片段（10E10 拷貝/uL） Yw14161417 10 uL
CPIV 探針（5.4nM，5FAM-3HBQ1） Yw1418 25 uL（棕色）
超純水 100935 1 mL
使用手冊(cè) 1 份 1 份
運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸、-20℃保存，有效期一年。 自備試劑 樣品。 使用方法 一、樣品 RNA 的制備
用自選方法純化犬副流感病毒樣品的 RNA，也可以另購(gòu)本公司的病毒RNAout
或柱式病毒 RNAout，上述兩款產(chǎn)品跟本試劑盒兼容。
二、制備 CPIV 陽(yáng)性片段的不同稀釋樣品（以制備 10-10E6 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度
為例。先將對(duì)照從 10E10 稀釋到 10E7 拷貝/uL。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此
下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他
成分）。
1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 1,2,3,4,5 和 6 號(hào)。
2. 用帶芯分別加入 45 uL 超純水（zui用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 6 號(hào)管中加入 5 uL 濃度為 10E7 的 CPIV 陽(yáng)性片段，充分震蕩 1 分鐘。
4. 換槍頭，從 6 號(hào)管中取 5 uL 溶液到 5 號(hào)管中，充分震蕩 1 分鐘。
5. 換槍頭，從 5 號(hào)管中取 5 uL 溶液到 4 號(hào)管中，重復(fù)上面的操作直到得到 6
個(gè)稀釋度的樣品。1-6 號(hào)管中陽(yáng)性對(duì)照片段的濃度分別為 10E1 到 10E6 拷貝
/uL。
6. 從 6 個(gè)管中分別取 5 uL 進(jìn)行定量 RT-PCR（見下步），每個(gè)樣品zui重復(fù) 3
次。
三、熒光定量 RT-PCR 反應(yīng)（30 uL 體系）
7. 在 PCR 管中加入下列成分（每個(gè)樣品好重復(fù)三次，這里只列出一次）：
成 份 樣品
6 個(gè)陽(yáng)性對(duì)照
稀釋梯度
陰性對(duì)照
CPIV 專一性引物對(duì) 2 uL 2 uL 2 uL
CPIV 專一性探針） 0.5uL 0.5uL 0.5uL
樣品 RNA（自備） 5 uL 無(wú) 無(wú)
CPIV 陽(yáng)性對(duì)照 無(wú)
5 uL（每個(gè)管加一個(gè)
稀釋度的對(duì)照）
無(wú)
補(bǔ)超純水到 15 uL 15 uL 15 uL
即用型熒光 RT-PCR Mix 15 uL 15 uL 15 uL
8. 輕柔混勻后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行定量 RT-PCR，反應(yīng)參數(shù)如下：
過(guò)程 溫度 時(shí)間 其他
RT（逆轉(zhuǎn)錄） 37℃ 30 分鐘
預(yù)變性 95℃ 5 分鐘
PCR 反應(yīng)
（40 個(gè)循環(huán)）
95℃ 30 s
49℃ 30 s
72℃ 30 s 采集數(shù)據(jù)
溶解曲線分析判斷產(chǎn)
物特異性
加熱到 95℃ 10 分鐘，然后降低到 55℃后，
按 0.5℃/10s 的升幅將溫度提高到 95℃，
其間記錄下熒光信號(hào)的變化。特異的 CPIV
PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物將在 82.2℃產(chǎn)生特異峰。
注意：儀器將檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物與探針雜交所產(chǎn)生的熒光信號(hào)，獲取數(shù)據(jù)。熒光
通道選擇：檢測(cè)通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，
請(qǐng)勿選擇 ROX 參比熒光。
四、數(shù)據(jù)處理
9. 以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待
測(cè)樣品濃度的 log 為橫軸，以 Ct 值為縱軸，通過(guò)待測(cè)樣品的 Ct 值計(jì)算出
樣品 DNA 的濃度。。 關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 豬傳染性胃腸炎病毒 RT-PCR 試劑盒（CAT#：11-TGEV-50）。