PCR法DNA探針標(biāo)記試劑盒（A）原理及特點(diǎn)PCR 標(biāo)記的原理是用帶標(biāo)記的 dNTP 進(jìn)行 PCR，zui后得到的 PCR 產(chǎn)物將帶有標(biāo)記，可以直接用于雜交試驗。

PCR法DNA探針標(biāo)記試劑盒（A）其原理示意圖如下：
PCR 法制備 DNA 探針示意圖

是在上述原理的基礎(chǔ)上開發(fā)，它具有下列特點(diǎn)：
1. 一站式，本試劑盒提供經(jīng)過優(yōu)化的試劑，不需要用戶自己摸索。
2. 足夠 10 次 50 uL 體系的常規(guī) PCR（用于制備標(biāo)記反應(yīng)的模板和設(shè)置對
照反應(yīng)）和 5 次 50 uL 體系的標(biāo)記反應(yīng)。
3. 一次標(biāo)記可以得到ug級的雙鏈DNA探針或約700ng 的單鏈DNA探針，
足夠多次雜交實驗用。
4. 既可用于制備雙鏈探針，也可以用于單鏈探針。
5. 90604A 需自備含標(biāo)記核苷酸的 dNTP， 90604B 和 90604C 分別含生
物素和標(biāo)記的底物。自備的標(biāo)記包括 fluorescein-dUTP、
hydroxycoumarin-dUTP、resorufin-dUTP 和 aminoallyl-dUTP 等。
6. 本產(chǎn)品得到的探針參入率一般為 4-5%（每 100 個核苷酸中有 4-5 個將
帶有非同位素標(biāo)記），有效降低了空間阻礙，檢測效果*。
7. 可以用于 Southern 和 Northern Blot、原位雜交、菌落和斑點(diǎn)印跡雜
交等分析。
規(guī)格及成分 成 份 編 號 5 次塑料盒包裝
2×標(biāo)記 PCR Mix 90604A 500 uL
dNTP，2 mM each 121128 50 uL
含 Biotin-11-dUTP 的 dNTP 90604B 25 uL（僅 B 有）
含 DIG-11-dUTP 的 dNTP 90604C 25 uL（僅 C 有）
超純水 100935 1 mL
使用手冊 1 份
注：標(biāo)記 PCR Mix 不含 dNTP。
運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年
自備試劑 DNA 模板和模板專一性引物。
使用方法 一：準(zhǔn)備工作
1. 按常規(guī)的方法設(shè)計 PCR 引物，使探針長度在 400-800bp 之間。過短則標(biāo)記參入少，
探針雜交信號強(qiáng)度減弱；過長則非特異雜交增加，背景變強(qiáng)。
2. 根據(jù) PCR 引物優(yōu)化 PCR 條件。
3. 由于標(biāo)記的 dNTP 比較珍貴，所以本試劑盒不推薦以基因組 DNA 或其他復(fù)雜 DNA
為模板直接進(jìn)行 PCR 標(biāo)記，而是建議采取下述的兩步法標(biāo)記來提高成功率，即先制
備非標(biāo)記 PCR 產(chǎn)物，再以之為模板制備標(biāo)記的 PCR 產(chǎn)物。
二：非標(biāo)記 PCR 產(chǎn)物的制備
4. 設(shè)置 50 uL PCR 的反應(yīng)體系：
成份 用量
2×標(biāo)記 PCR Mix 25 uL
dNTP，2mM each 5 uL
自備的探針引物一（10pmol/uL） 1 uL（10 uM）
自備的探針引物二（10pmol/uL） 1 uL（10 uM）
自備的模板 DNA 1 ug 基因組 DNA 或 1ng 質(zhì)粒 DNA
超純水 補(bǔ)到 50 uL
5. 按已經(jīng)優(yōu)化的 PCR 參數(shù)進(jìn)行 PCR。
6. 電泳檢測和膠回收所需的 PCR 產(chǎn)物，并定量。用 10 pmol 引物一般能得到 1ug 左
右的 PCR 產(chǎn)物（具體取決于 PCR 產(chǎn)物的長度）。注意：zui采取膠回收而不是 PCR
回收以避免殘留引物干擾后續(xù)的標(biāo)記 PCR。
三：標(biāo)記 PCR 反應(yīng)（zui做一個不加標(biāo)記的對照用于定量）
說明：在設(shè)置下面反應(yīng)時，如果加一種引物，就得到單鏈標(biāo)記的 PCR 產(chǎn)物；如果加
兩種引物，則得到雙鏈標(biāo)記的 PCR 產(chǎn)物。由于雙鏈 PCR 探針在雜交前雖然要變性成單鏈
后使用，但雜交時變性的雙鏈彼此還會復(fù)性，這種復(fù)性會與探針-靶 DNA 雜交反應(yīng)相競爭，
降低雜交效率，因此強(qiáng)烈推薦使用單鏈標(biāo)記的 DNA 探針。
成份 樣品 對照
2×標(biāo)記 PCR Mix 25 uL 25 uL
含 Biotin-11-dUTP 的 dNTP 或
含 DIG-11-dUTP 的 dNTP 或
自備的含其他標(biāo)記 dUTP 的 dNTP
5 uL 不加
dNTP，2mM 不加 5 uL
雙鏈標(biāo)記：探針引物一和引物二
單鏈標(biāo)記：探針引物一或引物二
每種 50 pmol
一種 50 pmol
每種 50 pmol
一種 50 pmol
上步膠純化所得 PCR 產(chǎn)物
（單鏈標(biāo)記可用 100ng）
10 ng 10 ng
超純水 補(bǔ)到 50 uL 補(bǔ)到 50 uL
注意：本試劑盒提供的 dNTP 混合物中，標(biāo)記底物與非標(biāo)記底物的比例已經(jīng)進(jìn)過優(yōu)化，
如果自備標(biāo)記 dUTP，其與 dTTP 的*比例需要優(yōu)化，標(biāo)記不同，比例不同。對
DIG-11-dUTP，*比例 1：3；對 BrdUTP，*比例為 1：1。
7. 按第 5 步的 PCR 參數(shù)進(jìn)行標(biāo)記 PCR，但需要進(jìn)行下列修改：一是循環(huán)數(shù)增加到 35-55
個循環(huán)。由于模板為純化后的 PCR 產(chǎn)物，探針對擴(kuò)增長度完整性要求不高（長度不
均的探針由于能形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，效果反而更好），所以可以增加循環(huán)數(shù)；二是延伸時
間增加 15 秒，因為標(biāo)記 dUTP 參入到 DNA 的速度比常規(guī)的 dTTP 慢；三是降低復(fù)
性溫度 5-7℃，因為標(biāo)記核苷酸參入到 DNA 后，新模板的 Tm 值將降低。
8. 標(biāo)記探針的定量：取標(biāo)記反應(yīng)和對照反應(yīng)的產(chǎn)物 1-5 uL，在瓊脂糖凝膠上跟濃度已
知的 DNA marker 一起電泳，并判斷探針的濃度。由于標(biāo)記反應(yīng)的 PCR 產(chǎn)物中額外
帶有非同位素的配體（生物素，等）、因此其泳動速度將慢于非標(biāo)記 PCR 產(chǎn)物
（但同位素標(biāo)記不能用此法）。是下圖是一個典型的雙鏈 PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果圖：

標(biāo)記的 DNA（右）與未標(biāo)記的 DNA（左）電泳比較
注意：如果擴(kuò)增的是單鏈 DNA 探針，其結(jié)合 EB 的能力遠(yuǎn)低于雙鏈 DNA（EB 是嵌
合到雙鏈堿基對之間的，而單鏈 DNA 沒有堿基對，只有一些局部區(qū)域折疊形成的有限雙
鏈區(qū)，因此能結(jié)合的 EB 很少），因此 EB 染色的強(qiáng)弱不能準(zhǔn)確反應(yīng) DNA 的濃度，可以采
用銀染定量（跟 marker 比較）。一般 100ng 模板按上述條件經(jīng)過單鏈 PCR 擴(kuò)增可得到
700ng 左右探針。
9. 剩余的 PCR 標(biāo)記產(chǎn)物可以不經(jīng)過純化，直接加入（對單鏈 PCR 探針）雜或加熱變性
并急冷后加入（對雙鏈 PCR 探針）到雜交液中使用。如果暫時不用請放-20℃長期保
存。如果需要純化，請使用乙酸銨/乙醇沉淀法。
關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 柱式 Sephadex 核酸探針純化試劑盒