標簽選擇:
親和標簽:蛋白重組表達過程中采用親和標簽融合表達有兩方面的作用:一方面是為了使蛋白純化過程變得更加容易;另一方面是為了促進某些不溶性蛋白可溶。蛋白標簽可分兩類:一類是短肽類標簽;一類是長肽以融合蛋白(fused partner)形式共表達。使用不同的蛋白標簽需要根據(jù)具體案例來分析。
不同的系統(tǒng)步驟稍微有些不同的,大致步驟如下:
真核表達系統(tǒng)的重組蛋白表達步驟:
a. 選擇表達載體和宿主細胞(常用的CHO和HEK293)
b. 表達載體的構(gòu)建
c. 無內(nèi)毒素的質(zhì)粒抽提
d. 細胞瞬時轉(zhuǎn)染
e. 表達小試,條件優(yōu)化
f. 表達分析和鑒定(SDS-PGAE和WB)
g. 大量表達
h. 親和純化
i. 檢測和鑒定
僅供科研實驗產(chǎn)品屬性:
產(chǎn)品名稱 | 物種 | 性狀 | 來源 |
羧酸酯酶5A(CES5A)活性蛋白 | Homo sapiens (Human,人) | 凍干粉 | 原核表達 |
英文名稱:Active Carboxylesterase 5A (CES5A)
CES7; CES4C1; CES5; CAUXIN; Carboxylesterase-like urinary excreted protein homolog
酶與激酶
物種:Homo sapiens (Human,人)
緩沖液成份:PBS, pH7.4, containing 0.01% SKL, 5% Trehalose.
性狀:凍干粉
純度:> 90%
等電點:5.9
應(yīng)用:Cell culture; Activity Assays.
規(guī)格10μg 50μg 200μg 1mg 5mg
相關(guān)產(chǎn)品:
TP I (topoisomerase I 0.5mgTP I (topoisomerase I ) 拓普西異構(gòu)酶Ⅰ抗原
ARL6IP6 Protein Human 重組人 ARL6IP6 蛋白 (Fc 標簽)
Shiga toxin II subunit B重組腸出血性大腸桿菌 (EHEC) stx2B / Shiga toxin II subunit B 蛋白 (His 標簽) Protein
LAMP3 Protein Human 重組人 CD208 / LAMP3 / DC-LAMP 蛋白 (Hi
原核表達系統(tǒng)的重組蛋白表達步驟:
a. 選擇表達載體
b. 密碼子優(yōu)化
c. 基因合成/亞克隆
d. 轉(zhuǎn)化表達菌株
e. 蛋白表達小試分析
f. 如果蛋白可溶,蛋白親和純化
g. 如果蛋白不可溶,則需要變復性來制備可溶蛋白。
h. 鑒定,包括SDS-PAGE和WB鑒定
GZMH蛋白;表達蛋白的分析、純化、檢測
誘導表達成功后,表達蛋白的分析、純化、檢測應(yīng)該順當,按一般的實驗步驟做沒太大的問題。
操作步驟 :
根據(jù)使用量,取每 1mL RIPA 加入 10uL PMSF,使 PMSF 的zui終濃度為 1mM。混勻備用(PMSF 現(xiàn)用現(xiàn)加)。
1、樣品前處理:
a)對于貼壁細胞:去除培養(yǎng)液,用 PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。按照 6 孔板每孔細胞量加入150-250 uL 裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下,使裂解液和細胞充分接觸。
b)對于懸浮細胞:離心收集細胞,用手指把細胞用力彈散。按照6孔板每孔細胞量加入150-250 uL 裂解液的比例加入裂解液,再用手指輕彈以充分裂解細胞。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細胞沉淀。如果細胞量較多,必需分裝成 50-100 萬細胞/管,然后再裂解。
c)對于組織樣品: 切成細小的碎片。按照每 20mg 組織加入 150-250 uL 裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當添加更多的裂解液,如果需要高濃度的蛋白樣品,可以適當減少裂解液的用量)。用玻璃勻漿器勻漿,直至充分裂解。
2、后處理:
將裂解后的樣品 10000-14000g 離心 3-5 分鐘,取上清,即可進行后續(xù)的蛋白濃度測定、SDS-PAGE、Western blotting 和免疫沉淀等操作。
生殖支原體PCR檢測試劑盒 英文名稱; Mycoplasma genitaliumPCR 50T
施氏油脂線蟲PCR檢測試劑盒 英文名稱; Elaeophora schneideriPCR 50T
飾紋汀蛙虹彩病毒PCR檢測試劑盒 英文名稱; Boheliridovirus(BIV)PCR 50T
嗜吞噬細胞無漿體PCR檢測試劑盒 英文名稱; Anaplasma phagocytophilumPCR 50T
MGr1-Ag/37LRP(P37-kDa laminin receptor precursor) 層粘連蛋白受體1抗體Multi-class antibodies規(guī)格: 0.5mg
Anti-beta-Amyloid(1-28) β淀粉樣肽(1-28)抗體Multi-class antibodies規(guī)格: 0.1ml
Rhesus antibody Rh Phospho-BLNK(Tyr491) 0酸化T淋巴細胞連接蛋白抗體 規(guī)格 0.1ml
多聚賴酸溶液0.1%(Poly-L-Lysine)10X 10ml 免疫組化用
Vimentin 英文名稱: 波形蛋白抗體 0.1ml
DNAH7 英文名稱: 軸絲動力蛋白7抗體 0.2ml
Anti-beta-Amyloid(1-28) β淀粉樣肽(1-28)抗體Multi-class antibodies規(guī)格: 0.1ml
羧酸酯酶5A(CES5A)活性蛋白痘苗病毒PCR檢測試劑盒 英文名稱; Vaccinia Virus(VV)PCR
都柏林沙門氏菌PCR檢測試劑盒 英文名稱; Salmonella dublinPCR
東方泰勒蟲PCR檢測試劑盒 英文名稱; Theileria orientalisPCR
東方蜜蜂微孢子蟲PCR檢測試劑盒 英文名稱; Nosema ceranaePCR
注意事項:
1、不同細胞或組織樣品所需的固定時間有所不同,應(yīng)當根據(jù)細胞或組織的種類以及組織塊的大小來調(diào)整固定時間。
2、雖然作用溫和,但能硬化組織,固定時間過久會導致組織變脆,切片時易碎。因此固定時間通常不宜超過 24 小時。
3、醛基與抗原蛋白的氨基交聯(lián)形成羧甲基,使抗原決定簇的三維構(gòu)象出現(xiàn)空間障礙。分子間交聯(lián)形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可能部分或 掩蓋某些抗原決定簇,使之不能充分暴露,可造成假陰性的染色,影響免疫組化結(jié)果。因此,4%固定的細胞或組織樣品在進行免疫組化檢測時,有時需要對抗原先進行修復,然后才能進行免疫染色等后續(xù)操作。
4、本產(chǎn)品對人體有害,操作時請小心,并注意有效防護以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。
5、為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作