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Cy7 NHS ester|Cyanine7 NHS 使用操作步驟
閱讀：881 發(fā)布時間：2018-7-30Cy7 NHS ester
氨基活性的Cy7,近紅外熒光染料。此試劑可被用于產(chǎn)生Cy7-標記的生物分子，用于后續(xù)的小動物活體成像研究，藥物設計及相關實驗。Cy7中心加強聚亞甲基鏈的結構特點，與母結構相比其量子產(chǎn)率提高了20%，增加了其熒光亮度。
分子結構：
一般性質(zhì)：
外觀：綠色粉末
分子量：682.29
分子式：C41H48ClN3O4
溶解性：溶于有機溶劑（DMSO,DMF,二氯甲烷），不易溶于水
質(zhì)控：NMR 1H(95%)13C,TLC,功能測試
保存條件：保存：-20℃，避光保存24個月。運輸：常溫下多3周，避光，干燥。
光譜性質(zhì)：
大激發(fā)波長：750nm
在大激發(fā)波長下的消光系數(shù)：199000Lmol-1cm-1
大發(fā)射波長：773nm
熒光量子產(chǎn)率：0.3
供應商：陜西新研博美生物科技有限公司
產(chǎn)品說明：
菁染料是性能優(yōu)良的熒光標記染料，摩爾吸光系數(shù)在熒光染料中是高的，其琥珀酰亞胺酯是 常用的脂肪氨基標記試劑，廣泛用于蛋白、抗體、核酸及其他生物分子的標記和檢測。通過改變 次甲基鏈的長度，可改變其熒光發(fā)射波長，每增加一個雙鍵，按照Huoffman 規(guī)則正好紅移約100nm。 菁染料Cy3 和Cy5 已成為基因芯片的推薦熒光標記物；另外，Cy5， Cy5.5 和Cy7 的吸收在 近紅外區(qū)背景非常低，是熒光強度高、穩(wěn)定的長波長染料。特別適合于活體小動物體內(nèi)成像代 替放射性元素。但由于菁染料，尤其是不對稱菁染料的合成副反應多， 副產(chǎn)物極性相近，產(chǎn)物的 分離提純相當困難。菁染料特別是水溶性菁染料分子極性大，分離提純越加困難。
圖1. 脂溶性菁染料琥珀酰亞胺酯的結構式
圖2. 水溶性菁染料琥珀酰亞胺酯的結構式
圖3 菁染料琥珀酰亞胺酯的激發(fā)和發(fā)射波長光譜圖
供應商：陜西新研博美生物科技有限公司
菁染料琥珀酰亞胺酯（CyDye NHS）的標記：
菁染料和生物分子的比例F/P=4～12之間熒光強度高，F(xiàn)/P值過高熒光探針會自我淬滅并影響 生物分子的生物活性，標記生物分子適合是用單琥珀酰亞胺酯，但是用雙修飾的CyDye NHS并沒有 發(fā)現(xiàn)交聯(lián)。CyDye NHS標記抗體在pH (8.5～9.4)時10分鐘F/P可達5～6，而在pH 7.0幾乎不反應。我 們用不同比例的Cy3標記anti-glutathione-S-transferase (GST)多克隆抗體發(fā)現(xiàn)用1:1，5:1，10:1 和 20:1 標記時得到的F/P值分別是 0.28:1，1.16:1，2.3:1和4.6:1。
操作步驟：
一、 水溶性Cy3 NHS標記anti-GST多克隆抗體 市場上買到的抗體如果含有其它蛋白（例如serum albumin或gelatin等）或帶氨基的緩沖液會影 響標記，在標記前需純化。
1. 在1 L 0.15 M NaCl 溶液中透析anti-GST抗體(濃度為 0.5 mL at 3 mg/mL)，常溫透析4小時。
2. 在4°C用新鮮的1 L 0.15 M NaCl 溶液再透析過夜。
3. 第二天用1 L 0.1 M NaHCO3 (pH 8.3)透析4小時。
4. 用0.22 µm注射器過濾頭過濾抗體溶液。
5. 用0.1 M NaHCO3 稀釋少量的抗體，在280nm處測其紫外吸收值計算標記抗體的總量 （IgG antibody摩爾吸光系數(shù)170 000 M-1 cm-1 at 280 nm).
6. 用DMSO配置Cy3 NHS (MW 765.95) 溶液濃度為10 mg/mL；計算所需體積以得到想要的CyDye NHS 和抗體的比值(例如20:1)，然后慢慢將其加入到抗體溶液中，同時在暗處常溫緩慢攪拌45 分鐘。
7. 用1 L 0.15 M NaCl 溶液常溫避光透析4小時除去未標記上的Cy3。
8. 在4°C用新鮮的1 L 0.15 M NaCl 溶液再避光透析過夜。
9. 用1 L of 0.01 M PBS/ 0.01% N3化鈉溶液常溫避光透析4小時， 在4°C常溫避光再次透析過夜。
10. 用0.22 µm注射器過濾頭過濾抗體溶液。
11. 用0.01 M PBS/0.01 % N3化鈉整數(shù)倍稀釋標記抗體溶液，測量280nm（蛋白）和552nm（Cy） 處的紫外可見吸光度。
12. 產(chǎn)品冷凍干燥成粉末或在 0.01 M PBS/ 0.01% N3化鈉溶液中，-20℃避光儲存。
F/P計算：
Cy3在552nm摩爾吸光系數(shù)為150 000 M-1cm-1；此蛋白在280nm的摩爾吸光系數(shù)為170 000 M-1cm-1；不同蛋白的摩爾吸光系數(shù)不一樣；Cy3 染料本身在280 nm 的吸收是552nm處的8%。 按以下公式計算F/P值。 [Cy3] = A552/150000 [antibody] = {A280 - (0.08×A552)}/170000 F/P final= [Cy3]/[antibody]= {1.13×A552}/ {A280 - (0.08×A552)}
二、 水溶性Cy5 NHS標記 (D-ser2)-leucineenkephalin
1. Cy5 NHS 1.0 mg溶解于400 µL DMSO后，加入到1mL 的玻璃瓶中盛有(D-ser2)-leucine- enkephalin acetate (YSGFLT，0.75 mg) 的400 µL DMSO溶液。（Dye 和peptide 投料比是 1:1）
2. 然后加入15 µL三乙胺，常溫避光攪拌反應混合物過夜。
3. 用HPLC 純化蛋白，使用蛋白C18柱子(25 cm×10 mm)，每次上樣注入2×400 µL，30分鐘梯度洗 脫。從0.1% TFA水溶液到MeCN∶H2O（0.1% TFA）=70∶30，流速4mL /min。（對不同的蛋白 選擇不同的合適HPLC梯度流動相）
4. 收集適當?shù)纳珟Х澹瑯擞浂嚯牡谋Ａ魰r間比未標記的多肽長。
5. 產(chǎn)品冷凍干燥成粉末或在水溶液中，-20℃避光儲存；必要時可用質(zhì)譜表征。
6. CyDye標記的蛋白穩(wěn)定性取決于蛋白本身。例如標記的IgG在4 ℃可避光保存2月；更長期的保存 需加入等體積的甘油-20 ℃避光保存。
F/P計算：
Cy5 在650 nm 的摩爾吸光系數(shù)為250 000 M-1cm-1 ，所用蛋白在280 nm處的摩爾吸光系數(shù)為 170000 M-1cm-1；Cy5在280nm處的吸收是650nm處的5%。按以下公式計算F/P值。 [Cy5 dye] = (A650)/250 000 [peptide] =[A280 -(0.05×A650)]/170000 F/P final= [dye]/[peptide]= {0.68×A650}/ {A280 - (0.05×A650)}
三、 水溶性 CyDye SE標記OLIGO
氨基封端的OLIGO可以標記CyDye SE，但是非常困難；標記前因為OILGO經(jīng)氨水脫保護，請務 必洗滌掉所有的殘余氨水。然后將樣品真空干燥；然后溶于0.25 ml 的0.5 M NaCl 溶液中，用 Sephadex G-50脫鹽，用5.0 mM borate 緩沖液平衡到pH=8.0，然后用以上硼酸緩沖液沖下OLIGO。 然后濃縮至干的樣品溶于0.1 M carbonate buffer (pH 8.5-9.0)；在0.5mL碳酸緩沖液中30 nmoles的 OLIGO加入到CyDye SE的玻璃瓶中室溫避光，密閉攪拌反應60min。反應物經(jīng)Sephadex G-50或 RP-HPLC過柱純化，冷凍干燥后避光保存。
注意：Oligonucleotides 和oligopeptides由于太小經(jīng)常會留在過濾膜上或在凍存管內(nèi)貼壁成膜， 而無法標記。
四、 小動物活體成像領域的應用
活體動物體內(nèi)成像技術是指應用影像學方法，對活體狀態(tài)下的生物過程進行組織、細胞和分子 水平的定性和定量研究的技術。小動物活體成像是近年來在生物醫(yī)藥方面非?；钴S和前沿的領域， 在研究細胞行為，藥物活性和代謝，疾病的進展等方向取得了革命性的進步。分為生物發(fā)光成像（以 Caliper 和 Xengon 儀器為代表）和熒光成像（以 KODAK 和 CRI 儀器為代表）。
1、熒光成像的推薦步驟：
（1） SPF級 BALB/C裸鼠，6～8 周齡，18～20克，實驗前24 h 自由進食、飲水。 （2） 于實驗裸鼠腹腔內(nèi)注射2% Pelltobarbitalum Natricum 300µL(215 mg/ kg)麻醉動物。將裸鼠俯臥位平放于小動 物多光譜活體成像系統(tǒng)的記錄暗箱中。實驗時將Cy7或Cy7標記的生物分子或藥物應溶于水 （或甲醇/乙醇/乙二醇，有時DMSO 200uL能把小鼠殺死）稀釋后，于裸鼠尾靜脈注射200µL （濃度0.5 mg/mL），用量和時間需要客戶根據(jù)自己的儀器和藥物試劑等條件優(yōu)化。每 5min 記錄1 張動物在體內(nèi)發(fā)射熒光的成像圖片，分析熒光藥物的分布情況。對照鼠不注射 藥物，進行同時記錄。記錄結束后迅速解剖裸鼠的心、肝、脾、肺、腎等臟器，進行成像。
（3） Cy7 檢測時激發(fā)波長700～770 nm 帶通，發(fā)射波長790 nm 長通。液晶可調(diào)諧濾光片掃描范 圍 780～950 nm，掃描步進10 nm。曝光時間為500 ms。不同的藥物代謝時間不一樣，注射入 裸鼠體內(nèi)，熒光立即分布全身，然后逐步向膀胱聚集，呈現(xiàn)顯著的腎排泄的特點一般4～6 小 時，快的只有30 分鐘；如果是骨骼和鼻腔等部位靶點的Cy7 標記藥物，有客戶反映一周后 活體成像系統(tǒng)仍能檢測到熒光成像。器官切片觀察：將解剖的器官迅速放置于4%多聚甲醛固 定4 小時以上，0%，20%，30%PBS 蔗糖依次沉底，20µm 切片，多聚賴氨酸洗過的載玻片 貼片，晾干，DAPI 染色。共聚焦顯微鏡觀察，激光器為氦氖 633 nm。
2、熒光成像常見問題
（1） 什么類型的小鼠適合活體成像？ 毛發(fā)對光有散射，建議用裸鼠。
（2） 給裸鼠注射的建議和大注射試劑體積？ 試劑的體積用量根據(jù)所采取的方式不同而不同，下面是體重 25g 的裸鼠注射量。 Route Recommended Maximal 靜脈注射 Intravenous (IV) 50～125 µL 200 µL 腹腔注射 Intraperitoneal (IP) 500 µL 2 mL 皮下注射 Sub-cutaneous (SC) 100～250 µL 1 mL
（3） 注射針頭的尺寸是多少？ 推薦使用具有固定針頭的28～32 號結核菌素或胰島素注射器（0.3 或1mL）
（4） 腫瘤成像需要注射多大劑量的標記抗體？ 推薦起始用量50µg 來優(yōu)化合適用量。
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