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快速深度單克隆抗體 De novo 測(cè)序
閱讀：1646 發(fā)布時(shí)間：2019-5-16抗體藥物的特異性和有效性高度依賴于抗體的氨基酸序列 和抗體上存在的特異性翻譯后修飾。在單克隆抗體的研發(fā) 階段，主要是通過 DNA 測(cè)序來(lái)進(jìn)行初次驗(yàn)證，但是對(duì)于一 些預(yù)臨床的抗體藥物，可能來(lái)自于免疫的宿主、商業(yè)化的 抗體產(chǎn)品、合作實(shí)驗(yàn)室的抗體樣品或者來(lái)自于雜交瘤細(xì)胞 的產(chǎn)物，很多都無(wú)法得到其 cDNA 序列；在這種情況下， 我們需要直接在蛋白水平進(jìn)行單抗分子的完整氨基酸序列 及其翻譯后修飾分析，從而解決預(yù)臨床實(shí)驗(yàn)中存在的一些 問題，同時(shí)對(duì)單抗產(chǎn)品的質(zhì)量進(jìn)行控制分析。
在沒有蛋白氨基酸序列的前提下進(jìn)行蛋白的氨基酸 序列和翻譯后修飾分析稱為蛋白從頭測(cè)序（de novo sequencing）。實(shí)現(xiàn)蛋白從頭測(cè)序主要有兩種方法： Edman 降解法和質(zhì)譜分析法。Edman 降解法一般適合 15-20 個(gè)氨基酸組成的肽段，不能超過 30 個(gè)氨基酸，且對(duì) 于樣品純度要求也比較高，至少 97% 純度以上；同時(shí)還 要進(jìn)行蛋白酶解、肽段分離純化和肽段逐一上機(jī)測(cè)試，另 外，對(duì)于一個(gè)單抗進(jìn)行 Edman 降解測(cè)序的時(shí)間成本和經(jīng) 濟(jì)成本也比較高。而與傳統(tǒng)的 Edman 降解法相比，基于 質(zhì)譜的方法更加高通量、率和低成本，即使在已知蛋 白氨基酸序列的情況下，從頭測(cè)序的方法也可以發(fā)現(xiàn)一些 新的蛋白變體，這些蛋白變體可能來(lái)自未知的突變、剪切 拼接和各種翻譯后修飾，從而為單抗序列提供更加全面的 信息，因此基于質(zhì)譜的蛋白 de novo 測(cè)序法已經(jīng)逐漸進(jìn)入 生物制藥產(chǎn)品的研發(fā)階段。
質(zhì)譜從頭測(cè)序的方法簡(jiǎn)單、快速并且直接，但是也存在很 多挑戰(zhàn)：為了得到盡可能豐富的碎片信息，我們需要采用
多種酶酶切和多種質(zhì)譜碎裂方式組合的高分辨、高質(zhì)量精 度質(zhì)譜進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，然后通過蛋白 de novo 測(cè)序軟件的 分析和拼接，得到終的單抗氨基酸序列信息，分析流程 如圖 1 所示。在此，我們使用了 Trypsin，Chymotrypsin， LysC，GluC 和 AspN 5 種酶進(jìn)行多酶酶切，同時(shí)使用我們新的三合一超高分辨質(zhì)譜 Fusion Lumos 進(jìn)行高質(zhì)量的 高能碰撞解離（HCD）和電子轉(zhuǎn)移解離（ETD）數(shù)據(jù)采集。 目前，在質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集過程中，常用的碎裂方式為：碰撞 誘導(dǎo)激活解離（CID）和高能碰撞解離（HCD）兩種解離方式， 由于 HCD 碎裂產(chǎn)生的二級(jí)原始譜圖的質(zhì)量更好，與理論 的匹配度更高，因此我們更多的采用 HCD 來(lái)進(jìn)行二級(jí)碎 裂，產(chǎn)生相應(yīng)的 b，y 碎片離子。而電子轉(zhuǎn)移解離（ETD） 作為一種補(bǔ)充碎裂方式，可以產(chǎn)生與 b，y 離子互補(bǔ)的 c， z 離子，從而更加準(zhǔn)確的確定氨基酸序列；另外 ETD 可以 保留側(cè)鏈易于丟失的一些翻譯后修飾基團(tuán)，比如磷酸化基 團(tuán)，因此可以準(zhǔn)確的確定蛋白質(zhì)翻譯后修飾的位點(diǎn)；同時(shí)由于電子轉(zhuǎn)移的特征，ETD 偏向于碎裂帶電荷數(shù)目比較高、 質(zhì)核比相對(duì)比較低的肽段，從而可以實(shí)現(xiàn)一些大肽段的有 效鑒定。綜合考慮，ETD 與 HCD 相互結(jié)合，可以準(zhǔn)確確 定完整的氨基酸序列以及翻譯后修飾位點(diǎn)的信息。
2 實(shí)驗(yàn)部分 2.1 儀器和試劑
質(zhì)譜儀器：賽默飛Fusion Lumos（賽默飛世爾科技，美國(guó)）；
色譜儀器：Easy Nano1000 液相色譜系統(tǒng)（賽默飛世爾科技， 美國(guó)）； 色譜柱：Home made Nano column（C18，2 µm， 75×150 µm，100 Å）；
試劑：色譜級(jí)甲酸、二次去離子水、色譜級(jí)乙腈；
2.2 儀器方法
色譜分析條件：具體見表 1；
質(zhì)譜分析條件：具體見表 2；
2.3 數(shù)據(jù)分析方法
使用 P Novo 軟件對(duì)原始譜圖進(jìn)行 de novo 分析，得到終 的肽段列表，然后再結(jié)合單克隆抗體的氨基酸結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行 蛋白水平上的數(shù)據(jù)整合。
3. 結(jié)果與討論 在 這 里， 我 們 使 用 了 Trypsin，Chymotrypsin，LysC， GluC 和 AspN 5 種酶進(jìn)行多酶酶切，同時(shí)使用我們新的 三合一超高分辨質(zhì)譜 Fusion Lumos 進(jìn)行高質(zhì)量的高能碰 撞解離（HCD）和電子轉(zhuǎn)移解離（ETD）數(shù)據(jù)采集，并且 通過 P Novo 軟件數(shù)據(jù)分析和數(shù)據(jù)整合，得到終的氨基 酸序列信息。
為了得到豐富的肽段和碎片離子的信息，我們使用了 5 種 不同的酶進(jìn)行酶解，相應(yīng)的一級(jí)色譜質(zhì)譜流出圖如圖 2 所 示，可以看到使用不同的酶所產(chǎn)生的肽段數(shù)目和豐度不 同：LysC 和 Trypsin 主要產(chǎn)生堿性氨基酸結(jié)尾的肽段， Chymotrypsin 主要產(chǎn)生疏水性氨基酸結(jié)尾的肽段，GluC 主要產(chǎn)生酸性氨基酸結(jié)尾的肽段，AspN 主要產(chǎn)生天冬氨 酸開頭的肽段，因此肽段的帶電荷數(shù)目和長(zhǎng)度不同，也 就造成有些肽段適合進(jìn)行 HCD 分析，有些肽段適合進(jìn)行 ETD 分析，所以我們?cè)诤罄m(xù)的質(zhì)譜分析中，分別對(duì)同一母 離子進(jìn)行了這兩種碎裂方式的解離，從而得到完整的 b， y，c，z 離子的信息，更加有利于后續(xù)的氨基酸序列的確 定和整合。以其中的一個(gè)母離子（ m/z =796.3997，z=3） 為例，如圖 3 所示，可以看到在不同的碎裂方式下，產(chǎn)生 的碎片離子的質(zhì)核比和強(qiáng)度也是不同的，因此可以得到更 加全面的肽段氨基酸序列的信息。
基于高質(zhì)量精度、高分辨率和高靈敏度兼具的原始質(zhì)譜數(shù) 據(jù)，我們通過 P Novo 軟件搜庫(kù)和人工整合后，得到了抗 體的完整序列信息。本文中以 Herceptin 抗體的 de novo 測(cè)序?yàn)槔?，終通過 5 種不同酶切和 2 種不同的碎裂方式， 得到了如圖 4 所示的氨基酸序列信息，并且與理論氨基酸 序列*一致，因此我們可以證明該分析流程可以直接應(yīng) 用到常規(guī)抗體的 de novo 分析中。
針對(duì)單抗重要的 CDR 區(qū)域，我們對(duì)來(lái)源于該區(qū)域肽段 的 HCD 和 ETD 原始譜圖分別進(jìn)行了確認(rèn)。以輕鏈區(qū)域的 RASQDVNTAVAWYQQKPGK 為例，該肽段對(duì)應(yīng)的 HCD 和 ETD 碎片離子匹配譜圖如圖 5 所示，HCD 碎裂譜圖中碎片 離子的覆蓋度為 78%，ETD 碎裂譜圖中碎片離子的覆蓋度 為 86%，兩者結(jié)合可以實(shí)現(xiàn)碎片離子的* 覆蓋，由此 我們可以確定該 CDR 區(qū)域的氨基酸序列信息。同理，其它 的 CDR 區(qū)域也都分別進(jìn)行了 HCD 和 ETD 譜圖的確認(rèn)，另 外對(duì)于 Fab 和 Fc 區(qū)域，也都進(jìn)行了譜圖確認(rèn)。由此可見 該分析流程可以準(zhǔn)確、快速的應(yīng)用到其它的蛋白藥物的 de vovo 分析中。
4. 結(jié)論 本文基于新的三合一超高分辨質(zhì)譜平臺(tái) Fusion Lumos, 通 過 Trypsin，LysC，Chymotrypsin，GluC 和 AspN 5 種酶進(jìn) 行多酶酶切，采用 HCD 和 ETD 兩種互補(bǔ)碎裂方式，以及后 續(xù)的軟件分析和人工確認(rèn)，建立了單抗藥物簡(jiǎn)單、快速的 De novo 質(zhì)譜測(cè)序分析流程，為未知氨基酸序列蛋白藥物的 分析和確認(rèn)提供了質(zhì)譜方法，有望大規(guī)模應(yīng)用于生物制藥企 業(yè)的早期研發(fā)中。