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用于營養(yǎng)標(biāo)簽的食品基質(zhì)中脂溶性維生素的分析
閱讀：615 發(fā)布時(shí)間：2022-9-17引言維生素是維持機(jī)體健康生長且必須從食物中獲取的微量營養(yǎng)物質(zhì)。維生素一般被分為兩類，水溶性維生素和脂溶性維生素。由于食品中存在從納克到微克級(jí)不同含量水平的維生素，因而像嬰幼兒配方奶粉中的維生素，需要標(biāo)示其含量是美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）的一項(xiàng)強(qiáng)制性規(guī)定。各維生素化學(xué)性質(zhì)的差異使得所有維生素的共同提取和分析挑戰(zhàn)?；诖耍苄院椭苄跃S生素的分析通常分別進(jìn)行。之前的一篇安捷倫應(yīng)用解決方案1提供了同時(shí)分析 10 種水溶性維生素的方法。本研究探討了同時(shí)分析 9 種脂溶性維生素的方法，這些都是食品中常見的脂溶性維生素。盡管各種脂溶性維生素的提取步驟不盡相同，但文中建立的分析方法可通過一次 LC 運(yùn)行對(duì)分析物定量，從而降低了分析難度。本文采用 UV 檢 測，建 立了 耗 時(shí) 大 約15 min、靈敏度高、耐用性好的方法，可同時(shí)分析 9 種脂溶性維生素，并可將該 HPLC 法轉(zhuǎn)換為耗時(shí)僅 3.5 min 的UHPLC 法，滿足了特別需要短分析時(shí)間的用戶。
實(shí)驗(yàn)部分儀器和軟件采用包含以下模塊的 Agilent 1260 Infi nity四元泵 LC 系統(tǒng)：• 集成真空脫氣機(jī)的 Agilent 1260 Infi nity四元泵（G1311B）• Agilent 1260 Infi nity 高效自動(dòng)進(jìn)樣器（G1367E）• Agilent 1260 Infi nity 柱溫箱（G1316C）• 配備 60 mm 光程流通池的 Agilent 1260Infi nity 二極管陣列檢測器（G4212B）采用包含以下模塊的 Agilent 1290 Infi nityLC 系統(tǒng)建立并實(shí)現(xiàn) UHPLC 分析：• 集成真空脫氣機(jī)的 Agilent 1290 Infi nity二元泵（G4220 A）及 100 µL Jet Weaver混合器• Agilent 1290 Infi nity 高效自動(dòng)進(jìn)樣器（G4226A）• Agilent 1290 Infi nity 柱溫箱（G1316C）• 配備 10 mm 光程流通池的 Agilent 1290Infi nity 二極管陣列檢測器（G4212A）
色譜柱：• Agilent Poroshell 120 EC-C18 色譜柱，內(nèi)徑 2.1 mm，柱長 75 mm，填料粒徑 2.7 µm（697775-902）• Agilent Poroshell 120 EC-C18 色譜柱，內(nèi)徑 3.0 mm，柱長 150 mm，填料粒徑 2.7 µm（693975-302）軟件：• 安捷倫化學(xué)工作站（B.04.02 版）試劑和材料所有化學(xué)藥品和溶劑均為色譜級(jí)。高純水由 Milli Q 水純化系統(tǒng)（Millipore Elix10，Millipore，USA）制備。超梯度級(jí)的乙腈和甲醇購自 Lab-Scan 公司（泰國曼谷），Biotech 級(jí)的四氫呋喃（THF）購自 Sigma 公司（德國）。洗脫液添加劑醋酸購自 Fluka 公司（德國），本研究所用的其它化學(xué)品均為 Aldrich 公司（印度）產(chǎn)品。標(biāo)準(zhǔn)品：甲萘醌（K3）、亞麻酸（6-ω 脂肪酸）、視黃醇、視黃酸、膽骨化醇（D3）、生育酚用于本研究中回收率測定和營養(yǎng)標(biāo)示分析的嬰幼兒配方奶粉和復(fù)合維生素片均購自當(dāng)?shù)亍?/span>
往 5 g 嬰幼兒配方奶粉或單片復(fù)合維生素片中加入 25 ng 標(biāo)準(zhǔn)品，通過加標(biāo)和不加標(biāo)樣品分析進(jìn)行回收率研究。該方法可有效轉(zhuǎn)移至 UHPLC。本文中評(píng)價(jià)了各種維生素的 LOD、LOQ 和線性關(guān)系，并通過峰面積和保留時(shí)間的 RSD 評(píng)價(jià)方法的精密度，同時(shí)繪制了所有維生素的線性曲線。
結(jié)果與討論分離與檢測采用 Agilent Poroshell 120 EC-C18（3.0 mm x 150 mm，2.7 µm）色譜柱使9 種脂溶性維生素 13 min 內(nèi)得到分離?；诜肿咏Y(jié)構(gòu)的差異，不同維生素的最大吸收波長不同。9 種維生素的色譜洗脫模式見圖 1，各維生素及其最大吸收波長如表 2 所示。216 nm 所檢測色譜圖中的基線漂移是因?yàn)樵谔荻冗\(yùn)行中流動(dòng)相改性劑的比例發(fā)生了變化。采用化學(xué)工作站軟件中的峰純度檢測功能考察每個(gè)色譜峰的純度，然后評(píng)價(jià)方法的專屬性。本文中方法學(xué)驗(yàn)證內(nèi)容包括了精密度、線性范圍、準(zhǔn)確度、專屬性、回收率和耐用性實(shí)驗(yàn)
保留時(shí)間（RT）和峰面積的精密度計(jì)算進(jìn)樣量為 50 ng 的 9 種維生素的保留時(shí)間（RT）和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）以評(píng)價(jià)方法的精密度。測得峰面積的 RSD 最大值為 0.035%，保留時(shí)間的RSD 最大值為 0.04%。9 種維生素的峰面積和保留時(shí)間的 RSD 值如圖 4 所示。
耐用性通過刻意改變六個(gè)關(guān)鍵的方法參數(shù)評(píng)價(jià)該方法的耐用性，同時(shí)計(jì)算所產(chǎn)生的峰面積和保留時(shí)間的偏差，并與原方法結(jié)果進(jìn)行比較。例如，維生素的加標(biāo)混合樣品平行測定 6 次，保留時(shí)間和峰面積的允許偏差分別為 ± 3% 和 ± 5%。耐用性研究結(jié)果匯總見表 4。耐用性研究考察了增大流速、改變流動(dòng)相組成及柱溫，結(jié)果表明保留時(shí)間的偏差均在允許的限度內(nèi)。但是，洗脫梯度斜率變化的影響較大，測得的保留時(shí)間偏差超過了限度。除了8 種維生素峰面積的偏差在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中均在允許的限度內(nèi)。峰面積受流速、梯度斜率、柱溫、流動(dòng)相組成和檢測波長的影響很大。并且檢測波長需嚴(yán)格控制。耐用性結(jié)果表明，該方法對(duì)于常規(guī)檢測是可靠的，在很大程度上，測定結(jié)果未受參數(shù)改變的影響。
……
結(jié)論本研究使用 Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱對(duì) 9 種脂溶性維生素進(jìn)行分離和定量。先用 Agilent 1260 Infi nity LC 系統(tǒng)建立了耐用、耗時(shí) 15 min 的 HPLC 梯度洗脫方法。該方法可成功地用于定量分析維生素，如甲萘醌、亞麻酸以及不同形式。本方法的線性范圍寬，涵蓋許多食品中這些維生素可能的濃度。梯度洗脫可確保更好的色譜分離、提高靈敏度并減少基質(zhì)干擾。該方法簡便、快速、專屬性強(qiáng)、靈敏度高，并具有良好的精密度、線性關(guān)系和回收率。通過嬰幼兒配方奶粉和復(fù)合維生素片中的定量分析證實(shí)了該方法的高效性。之后，將該方法轉(zhuǎn)換為采用 Agilent 1290Infi nity LC 系統(tǒng)的 UHPLC 法，其耗時(shí)僅3 min，并可節(jié)省 66% 的分析時(shí)間和溶劑。采用 Agilent 1260 Infi nity LC 系統(tǒng)和 Agilent 1290 Infi nity LC 系統(tǒng)的方法可用于脂溶性維生素準(zhǔn)確的常規(guī)營養(yǎng)標(biāo)示分析。