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液質(zhì)聯(lián)用進(jìn)行菠菜中殘留農(nóng)藥檢測
閱讀：569 發(fā)布時(shí)間：2023-2-19摘要本應(yīng)用方法介紹了一種簡單、快捷、廉價(jià)、有效、耐用、安全的(QuEChERS) EN 樣品制備方法及其應(yīng)用，該方法可用于菠菜中 13 種具代表性的不同種類殘留農(nóng)藥的萃取和凈化。菠菜被認(rèn)為是一種高色素基質(zhì)，而用于高色素瓜果和蔬菜的 EN 分散固相萃取試劑盒是有選擇性的。試劑盒中將添加了 7.5 mg/mL 石墨化碳黑（GCB）的乙腈萃取劑。通過液相色譜和電噴離子化串聯(lián)質(zhì)譜儀聯(lián)用（LC-ESI-MS/MS），正離子模式多重反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）測定菠菜萃取物中的殘留農(nóng)藥。通常認(rèn)為 GCB 對平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥萃取有顯著的負(fù)影響。但是，本文研究結(jié)果顯示在 EN 分散固相萃取試劑盒中添加少量 GCB 時(shí)對平面結(jié)構(gòu)農(nóng)藥的影響可以忽略，所得定量結(jié)果也是可以接受。本指南給出的菠菜中農(nóng)藥的定量限（LOQ）為 5 ng/g，大大低于最高允許殘留（MRL）?；厥赵囼?yàn)的加標(biāo)水平分別為 10、20、200 ng/g，表明回收率在 60%-99%范圍內(nèi)（平均 85.4%），相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于11%（平均 5.5%）。
引言EN QuEChERS 方法被廣泛的用于食品中的農(nóng)藥分析，特別是在歐洲。該方法采用乙腈作萃取劑，然后通過利用無水硫酸鎂、氯化鈉和檸檬酸鹽緩沖液從樣品中的鹽析出水來誘導(dǎo)液-液分層。為了凈化的需要，采用了分散固相萃取步驟，結(jié)合乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)的使用以除去脂肪酸及其它組分，無水硫酸鎂則用來吸收萃取物中的殘留水。根據(jù)不同的食物基質(zhì)，該步驟中可能會(huì)增加其它成分，如用于除去色素和甾醇的石墨化炭黑（GCB）或者用于除去更多類脂和脂肪油的 C18 等。由于含有高濃度的葉綠素，菠菜被認(rèn)為是一種高色素蔬菜。因此，本應(yīng)用選用適用于高色素量商品的 EN 分散固相萃取試劑盒。在這些試劑盒中，除了 25 毫克 PSA 和 150 毫克 MgSO4 外，每毫升乙腈萃取劑中還加入了 7.5 毫克 GCB。GCB 可以吸附平面分子如色素和甾醇，因此它對于凈化色素基質(zhì)如菠菜是非常有幫助的。GCB 添加量越大，平面分子吸收得越多，可得到更干凈基質(zhì)的樣品。EN 法和 AOAC 法在凈化高色素基質(zhì)方面的主要區(qū)別是在分散固相萃取步驟中 GCB 添加量不同是。AOAC 法中 GCB 的添加量較高（每毫升乙腈萃取劑中添加 5 毫克 GCB），EN 法中 GCB的添加量較低 (處理“有色"產(chǎn)品時(shí)，每毫升乙腈萃取劑中添加2.5 毫克 GCB；處理“深色"產(chǎn)品時(shí)，每毫升乙腈萃取劑中添加7.5 毫克 GCB)。GCB 對平面農(nóng)藥萃取的影響隨所用方法的不同而有所區(qū)別。AOAC 法可制得基質(zhì)更干凈的樣品，但是易造成平面農(nóng)藥分子的大量損失；與此相反，EN 法造成的平面農(nóng)藥分子損失較少，但樣品基質(zhì)更為復(fù)雜。
之前，我們曾介紹過一種改進(jìn)的 AOAC 法，即在分散固相萃取中添加甲苯可明顯提高高色素基質(zhì)（如菠菜）中平面結(jié)構(gòu)農(nóng)藥的萃取效率[3]。隨后，我們采用原始 AOAC 法（不含甲苯）和改進(jìn)的AOAC 法（添加甲苯）相結(jié)合闡明了 Bond Elut QuEChERS AOAC試劑盒在菠菜中農(nóng)藥殘留分析方面的性能[4, 5]。在這項(xiàng)研究中，采用 13 種農(nóng)藥評價(jià)了安捷倫 EN 緩沖萃取劑(部件號 5982 - 5650)和Bond Elut QuEChERS EN 分散固相萃取試劑盒在高色素水果和蔬菜(部件號 5982-5321 和 5982-5356)分析中的性能。也驗(yàn)證了該方法的重現(xiàn)性和回收率也。表 1 是菠菜中各種農(nóng)藥的化學(xué)和法規(guī)信息。
實(shí)驗(yàn)部分藥品和試劑所用試劑和溶劑均為高效液相純級或分析純級。甲醇和甲苯購自霍尼韋爾（美國，馬斯基根）。乙腈(ACN)、二甲基亞砜(DMSO)、冰醋酸(HAc)購自 Sigma- Aldrich 公司（美國，密蘇里州圣路易斯）。醋酸銨(NH4OAc)購自費(fèi)舍爾化工(美國，新澤西，F(xiàn)air Lawn)。甲酸(FA)購自 Fluka(德國，Sleinheim)。農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物（磷酸三苯酯，TPP）分別購自 Sigma- Aldrich 公司（美國密蘇里州圣路易斯）、Chem Service 公司（美國賓夕法尼亞州西切斯特）、Ultra Scientific 公司（美國羅得島州北金斯敦）或 AlfaAesar (美國，馬薩諸塞州，Ward Hill)。溶液及標(biāo)準(zhǔn)品將 19.27 克 NH4OAc 粉末溶解在 250 mLMilli-Q 超純水中，用 PH計(jì)監(jiān)控，采用乙酸調(diào)溶液 PH 值到 5，得到 PH=5 的 1M 醋酸銨原液，并于 4 oC 保存。將 200mL MeOH 與 800mL Milli-Q 超純水混合，加入 5mL PH=5 的 1M 醋酸銨原液，混合均勻，得到MeOH/H2O=20：80、PH=5 的 5 mM 醋酸銨溶液。向 1L 乙腈中加入 5mLPH=5 的 1 M 醋酸銨原液，均勻混合后超聲 5 min，即得5 mM 醋酸銨乙腈溶液。1%甲酸的乙腈溶液可通過 100 mL 乙腈與1 mL 甲酸混合均勻得到。標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物（IS）儲(chǔ)備液(除多菌靈為 0.5 mg/ mL 外，其余均為 2.0 mg/ mL)分別用 MeOH，含 0.1 %甲酸溶液的乙腈或 DMSO配制，于-20 oC 下低溫儲(chǔ)存。1、5、20 µg/mL 的三種 QC 加標(biāo)溶液以乙腈和 0.1%甲酸溶液的水 1:1 混合作基質(zhì)，現(xiàn)配現(xiàn)用。制備10 µg/mL 標(biāo)準(zhǔn)品的乙腈/水（含 0.1% FA）=1:1 的加標(biāo)溶液，并通過適當(dāng)稀釋，用于獲得空白基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線。以含 0.1%甲酸溶液的 1:1 乙腈/H2O 為溶劑，制備 15 µg/mL 的 TPP 加標(biāo)溶液。
儀器和材料Agilent 1200 Series HPLC with Diode Array Detector (AgilentTechnologies Inc., CA, USA)配備二極管陣列檢測器的 Agilent 1200 系列高效液相色譜系統(tǒng)（美國，加州，安捷倫科技有限公司）配置電噴霧離子源的 Agilent 6410 三重串聯(lián)四級桿 LC / MS 系統(tǒng)（美國，加州，安捷倫科技有限公司）Agilent Bond Elut QuEChERS EN 萃取試劑盒，部件號 5982-5650和用于高色素水果和蔬菜的 Bond Elut QuEChERS EN 分散固相萃取試劑盒，部件號 5982 - 5321 和 5982- 5356（安捷倫科技有限公司，德州，美國)CentraCL3R 離心機(jī)（美國馬薩諸塞州 Thermo IEC）瓶口移液器（美國新澤西州，So Painfield，VWR）Eppendorf 微型離心機(jī)（美國紐約，Westbury，Brinkmann 儀器公司）
儀器條件LC/MS/MS 法如前所述[9]液相色譜條件色譜柱： Agilent ZORBAX 溶劑節(jié)省 Plus Eclipse Plus苯基-己基柱，3.0 x 150 mm, 3.5 µm（部件號 959963-312)流速： 0.3 mL/min柱溫： 30 oC進(jìn)樣量： 10 µL流動(dòng)相： A, PH=5 的 5 mM 乙酸銨 MeOH/H2O=20:80 溶液；B, PH=5 的 5mM 乙酸銨乙腈溶液洗針液： 1:1:1:1 乙腈/甲醇/異丙醇/水含 0.2%甲酸梯度： 流速時(shí)間 % 乙腈 (mL/min)0 20 0.30.5 20 0.38.0 100 0.310.0 100 0.313.0 停止后運(yùn)行： 4 分鐘總分析時(shí)間： 17 分鐘質(zhì)譜條件正離子模式氣體溫度： 350 oC氣體流速： 10 升/分霧化氣： 40 Psi毛細(xì)管電壓： 4000V分析物相關(guān)的其他條件列于表 2。
樣品制備樣品制備過程包括樣品粉碎，萃取/分離和分散固相萃取凈化等步驟，這在早期的應(yīng)用指南上有詳細(xì)的描述。[9]菠菜樣品處理過程與蘋果樣品處理過程很相似，但與一般的水果和蔬菜樣品處理相比，菠菜樣品處理的分散固相萃試劑盒適用于高色素量產(chǎn)品分析。簡單來說，首先將凍存的有機(jī)菠菜勻漿。取 10 克（±0.1 克）勻漿后的樣品放入 50 毫升離心管中。如需要，可先通過適當(dāng)?shù)腝C 加標(biāo)溶液(100 µL)對樣品進(jìn)行加標(biāo)，然后加入 66.7 µL IS 加標(biāo)溶液（15 µg/mL 的 TPP）。渦旋 30 秒，每個(gè)樣品管中加 10 mL 乙腈，蓋緊樣品管蓋，振搖 1 分鐘。每一個(gè)離心管中直接加入Agilent Bond Elut QuEChERS EN 萃取鹽包(部件號 5982-5650)及4 g 無水硫酸鎂、1 g 氯化鈉、1 g 檸檬酸鈉，0.5 g 檸檬酸氫鈉半水合物。蓋好管，用力振搖 1 分鐘，于 4000 rpm 離心 5 分鐘。1 mL 上層乙腈層轉(zhuǎn)入安捷倫分散型固相萃取柱的 2 mL 管中（部件號 5982-5321）；或 6 mL 上清液轉(zhuǎn)入安捷倫分散型固相萃取柱的 15 mL 管中（部件號 5982-5356 ）。2 mL 的管中含有 25 mgPSA，150 mg 無水硫酸鎂和 7.5 mg GCB，而 15 mL 管中則含有150 mg PSA，900 mg 無水硫酸鎂及 45 mg GCB。蓋緊管，用力搖 1 分鐘。將 2 mL 管 放入微 型離心 機(jī)中 13000 rpm 離心2 min，15 mL 管在標(biāo)準(zhǔn)離心機(jī)以 4000 rpm 離心 5 min。取 200 µL等份的萃取液轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣瓶中，立即加入 10 µL 1% 甲酸的乙腈溶液。然后加入 800 µL 水或者適量的標(biāo)準(zhǔn)品溶液（制備成水溶液）。蓋緊樣品管，渦旋混勻，以備 LC/MS/MS 分
結(jié)果與討論QuEChERS 方法為農(nóng)藥殘留分析提供了獲得高質(zhì)量結(jié)果的快速、簡便而廉價(jià)的方法。對于含色素的水果和蔬菜，在分散型固相萃取管中添加石墨化碳黑（GCB）可以提高色素和甾醇的清除效率。清除效率與 GCB 的加入量有關(guān)。添加 GCB 的量越多，處理后的基質(zhì)就會(huì)越干凈，最終樣品中的基質(zhì)干擾就越少。由于 GCB 也可能導(dǎo)致萃取過程中的平面結(jié)構(gòu)農(nóng)藥分子的清除，所以在 EN 分散固相萃取步驟中使用了非常少量的 GCB。與 AOAC 方法相比，用于色素性物質(zhì)的 EN 方法在分散固相萃取步驟中使用了非常少量的 GCB。對于像胡蘿卜、生菜這樣的普通色素性商品，每毫升乙腈萃取劑中添加 2.5 mg 的 GCB；對于高色素性商品如菠菜和紅甜椒，每毫升乙腈萃取劑中則需要添加 7.5 mg 的 GCB。[1]根據(jù)建議，我們研究中采用適用于高色素產(chǎn)品的 EN 分散萃取試劑盒。由于采用高色素試劑盒，EN 方法中的 GCB 用量仍然比AOAC 方法低得多，每 mL 乙腈萃取劑中只需添加 50 mg GCB。所以，很明顯，EN 方法中的基質(zhì)凈化效率要比 AOAC 法弱得多。通過 EN 方法處理得到的樣品仍然呈現(xiàn)深綠色，而先前經(jīng)過AOAC 法處理后的樣品幾乎呈無色透明狀。空白基質(zhì)的紫外色譜（l= 254 nm）也有差異，如圖 1 所示。EN 法處理的空白基質(zhì)中干擾峰更多，而且更多的雜質(zhì)在色譜柱或離子源處累積，可能對色譜柱及質(zhì)譜儀造成不利影響。然而，由于 LC/MS/MS 提供了選擇性，空白基質(zhì)的 MRM 色譜圖并沒有顯示任何目標(biāo)分析物的干擾峰。圖 2 顯示了空白基質(zhì)（添加內(nèi)標(biāo)物）和 50 ng/g 經(jīng)過 EN 分散萃取法處理的加標(biāo)菠菜萃取物的 LC/MS/MS 色譜圖。4 種農(nóng)藥包括多菌靈、噻菌靈、嘧菌環(huán)胺和吡蚜酮，由于具有平面結(jié)構(gòu)，在經(jīng)過原來的 AOAC 分散固相萃取方法處理時(shí)明顯損失。而在固相萃取步驟中，添加甲苯改進(jìn)該方法可以提高萃取效率[3,4]。為了研究 GCB 對于平面結(jié)構(gòu)農(nóng)藥的影響，我們比較了固相萃取步驟中分別添加和不添加甲苯時(shí)，對相同農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（50ng/g）水平加標(biāo)的菠菜樣品萃取效果。結(jié)果表明，在 EN 法中GCB 的使用量比較少時(shí)，平面農(nóng)藥很少或沒有損失，加入甲苯?jīng)]有明顯改善。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用了原始的 EN 方法。也考察了該方法的回收率和重現(xiàn)性，還對定量結(jié)果進(jìn)行了討論。