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固相萃取結(jié)合高效液相色譜測定蘋果汁中苯并咪唑抗真菌劑
閱讀：312 發(fā)布時(shí)間：2023-3-13摘要本應(yīng)用報(bào)告優(yōu)化了固相萃取（SPE）結(jié)合高效液相色譜（HPLC）萃取并定量測定蘋果汁中兩種抗真菌劑（多菌靈和噻菌靈）的方法。結(jié)果表明，采用安捷倫 Bond Elut SCX (60 mg,3 mL) 進(jìn)行固相萃取，用 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 column (4.6 mm × 100 mm,3.5 µm) 進(jìn)行 HPLC 分析，是萃取并分析這兩種化合物的組合。方法的回收率在 92.1到 99.4%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)低于 5%，檢出限為 4 µg/kg。
前言不同目的的農(nóng)藥濫用已日益凸顯出威脅植物、動(dòng)物及人類健康的嚴(yán)重環(huán)境問題。抗真菌劑就是這些農(nóng)藥中到一類，主要用于防止真菌造成的農(nóng)作物損害。抗真菌劑在全部所用農(nóng)藥中約占 20-25%。苯并咪唑抗真菌劑在農(nóng)業(yè)上是廣泛用于收獲前后控制廣譜病原體的系列化農(nóng)藥。這類物質(zhì)直接撒進(jìn)土壤，或噴霧在農(nóng)田里，并因此釋放到環(huán)境中。它們很容易通過根和葉滲入植物，也可以從農(nóng)田中直接進(jìn)入自然水源。大部分化合物在使用后都會(huì)在環(huán)境中長期存在，某些甚至存留數(shù)年。苯并咪唑系列中的兩個(gè)主要化合物是多菌靈和噻菌靈（表 1）。多菌靈對廣譜真菌病患具有預(yù)防和治療的雙重功能。它對人體、動(dòng)物和植物有毒性，并于很長時(shí)間內(nèi)存留在水中、廢水、土壤、農(nóng)作物和食品中。噻菌靈用于控制水果和蔬菜病害，如霉菌、腐爛和枯萎，還被用作除蟲的獸藥。用安捷倫 Bond Elut SCX SPE 小柱從蘋果汁中提取抗真菌劑。本應(yīng)用報(bào)告報(bào)導(dǎo)了對 SN/T 1753-2006 所述方法的應(yīng)用和優(yōu)化，以及對結(jié)果的確證。
實(shí)驗(yàn)材料和化學(xué)試劑所有試劑和溶劑均為 HPLC 級或分析純。抗真菌劑標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma-Aldrich 公司（中國，上海）。蘋果汁（食品級）購自當(dāng)?shù)厥袌?。磷酸鹽緩沖液：1.38 g 磷酸二氫鈉和 1.41 g 磷酸氫二鈉溶于1,000 mL 水中，調(diào) pH 至 3.0。用甲醇配制成儲備液 (0.1 mg/mL)，冷凍保存(–20 °C)。用甲醇稀釋儲備液以配制成工作溶液。工作溶液應(yīng)每周配制，需 4 °C 條件下保存。固相萃取小柱為安捷倫 Bond Elut SCX 3 mL, 60 mg（部件號5982-3236）。分析采用 Agilent 1200 高效液相色譜儀，配備可變波長檢測器（VWD）。分析柱為 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C183.5 µm 100 mm × 2.1 mm 內(nèi)徑（部件號 959793-902）。進(jìn)行 HPLC分析前用安捷倫 0.45 µm 濾膜（部件號 5185-5836）過濾樣品溶液。
HPLC 條件色譜柱： ZORBAX Eclipse Plus C18 100 mm × 4.6 mm3.5 µm （部件號 959793-902）流速： 1.0 mL/min進(jìn)樣體積： 20 µL檢測波長： 288 nm流動(dòng)相： 磷酸鹽緩沖液-乙腈（73:27）樣品制備稱量 10 g 蘋果汁，用水稀釋至 100 mL，用玻璃棒攪動(dòng)混合 1 分鐘。將稀釋后的樣品轉(zhuǎn)移到 250 mL 錐形燒瓶中，用 2 mol/L 氫氧化鈉溶液將 pH 調(diào)為 10。將樣品分成 2 或 3 份置于 50 mL 聚丙烯離心管中，于 4,000 rpm 離心 10 分鐘。將上清液合并到一個(gè)玻璃燒杯中。SPE 純化SPE 萃取步驟如圖 1 所示。安捷倫 Bond Elut SCX 小柱用 3 mL 甲醇活化，再用 3 mL 0.15 mol/L 氨水溶液靠重力流動(dòng)沖洗（流速約1 mL/min）。
以 1 mL/min 左右的速度將 10 mL 上清液加載到 Bond Elut SCX小柱上。待樣品流出后，分別用 2 mL 0.15 mol/L 氨水溶液、2 mL 甲醇/0.15 mol/L 氨水溶液(3:7)溶液、2 mL 0.1 mol/L 鹽酸溶液和 3 mL 甲醇沖洗小柱。所有三個(gè)沖洗步驟均靠重力流動(dòng)完成。丟棄所有洗脫液。用 2.0 kPa 負(fù)壓 1 分鐘抽干小柱。最后用 5 mL0.5 mol/L 氨甲醇溶液重力洗脫小柱。收集洗脫液，并用氮?dú)獯蹈?。用流?dòng)相復(fù)溶殘?jiān)⒍ㄈ苤?1 mL。再用 0.45 µm 濾膜過濾并分析。
結(jié)論安捷倫 Bond Elut SCX 提供了一種簡單而有效的小柱固相萃取方法，對蘋果汁中的抗真菌劑進(jìn)行了純化和富集。用標(biāo)準(zhǔn)溶液測定的回收率和重現(xiàn)性，符合測定蘋果汁中抗真菌劑殘留量測定的中國國家標(biāo)準(zhǔn)。蘋果汁中的雜質(zhì)很少，不會(huì)干擾任何抗真菌劑的分析。