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液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)牛奶中的重組牛生長(zhǎng)素
閱讀：665 發(fā)布時(shí)間：2023-4-6引言重組牛生長(zhǎng)素 (rbST)，也稱為生長(zhǎng)激素，用于產(chǎn)奶母牛以提高牛奶產(chǎn)量。不同的法規(guī)對(duì)它的使用都有所規(guī)定，但由于缺少對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)的有效方法 [1]，使得這些法規(guī)難以得到應(yīng)用。這可能引發(fā)動(dòng)物添加劑和食使用 LC-ESI-MS/MS 檢測(cè)牛奶中的重組牛生長(zhǎng)素應(yīng)用品安全方面的國際爭(zhēng)端。事實(shí)上，使用了這種激素的乳牛所產(chǎn)的奶中可能存在 rbST 殘留。為了檢測(cè)牛奶中的 rbST 殘留，已確定選擇對(duì)胰蛋白酶水解的 rbST N 末端肽鏈進(jìn)行分析，尤其是針對(duì)內(nèi)源性激素與重組激素所存在的差異。內(nèi)源性牛生長(zhǎng)激素的 N 末端氨基酸為丙氨酸，而在重組形式中則被蛋氨酸取代。本文闡述了使用 ESI(+)LC-MS/MS 檢測(cè) rbST 的方法。該方法成功應(yīng)用于加有 rbST 標(biāo)樣的牛奶樣品提取物。
實(shí)驗(yàn)部分蛋白質(zhì)和肽類標(biāo)準(zhǔn)品rbST 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品和重組馬生長(zhǎng)素 reST(EquiGen-5) 分別來自 Harbor-UCLA Medicalcenter, National Hormone and Pituitary Program(Torrance, CA, USA) 和 Bresagen Limited 公司(Thebarton, Australia)。以下序列的肽類標(biāo)準(zhǔn)品由 Millegen 公司 (Labege,France) 合成：MFPAMSLSGLFANAVLR (胰蛋白酶水解的 rbST N 末端肽鏈）、MFPAMPLSSLFANAVLR(胰蛋白酶水解的 reST N 末端肽鏈) 和 AFPAMSLSGLFANAVLR (胰蛋白酶水解的 bST N 末端肽鏈)。
儀器設(shè)備用于 N 末端肽鏈檢測(cè)的儀器設(shè)備及設(shè)置如下表所示。
LC儀器 Agilent 1200色譜柱 Column Interchrom ModuloCart QSUptisphere 3HDO 150 mm × 2 mm流動(dòng)相 A: 乙腈+0.1% 甲酸溶液B: 水+0.1% 甲酸溶液流速 0.3 mL/min進(jìn)樣量 20 µL梯度 時(shí)間（分鐘） %A0 105 5510 6015 10017 1020 10MS儀器 Agilent 6410 LC/MS 三重串聯(lián)四極桿電離模式 ESI (+)毛細(xì)管電壓 5000 V霧化器壓力 55 psi氣流 13 L/min氣體溫度 300 °C
選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)分析 (SRM) 方法參數(shù)為了獲得較好的特異性，在 SRM 模式下進(jìn)行檢測(cè)。監(jiān)測(cè)的 transition 如表 1 所示。
結(jié)果和討論三重串聯(lián)四極桿 MS-MS 和電噴霧電離模式方法學(xué)的應(yīng)用在本方法中，選用了正離子模式的電噴霧電離。事實(shí)上，這種表現(xiàn)為“軟"電離技術(shù)的電離模式對(duì)于肽類檢測(cè)最為合適。rbST N 末端肽鏈的電離產(chǎn)生兩種主要離子形式 (z=2 或 z=3)。這種基于三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜的方法學(xué)應(yīng)用具有很好的靈敏度和選擇性，并且有可能對(duì)所監(jiān)測(cè)信號(hào)實(shí)現(xiàn)定量分析。不同化合物的分離所開發(fā)的這種檢測(cè)方法不僅用于 rbST 的胰蛋白酶水解 N 末端肽鏈的檢測(cè)，還用于內(nèi)源性腦垂體牛生長(zhǎng)素 (bST) 和 reST 的胰蛋白酶水解 N 末端肽鏈的檢測(cè)。reST 被用作內(nèi)標(biāo)，因?yàn)樗陌被嵝蛄信crbST 具有高度的相似性。三種化合物得到了色譜分離，并用表 1 的 transition進(jìn)行分析。進(jìn)樣量為 0.2ng, bST、rbST 和 reST N 末端肽鏈所對(duì)應(yīng)的色譜圖如圖1所示。
低，但仍然是有效的，能夠清楚而明顯地顯示出來。本方法顯然能夠用于牛奶中 rbST 的準(zhǔn)確鑒定。
結(jié)論牛奶中的 rbST 通過 ESI(+)LC-MS/MS 得到了檢測(cè)。該方法顯示了非常好的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性。按照 2002/657 號(hào)法令中的限度要求，使用該方法成功地對(duì)加有 50ng.mL-1 rbST 的牛奶樣品進(jìn)行了檢測(cè)。