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液相色譜儀改進(jìn)對(duì)生物樣品中代謝物的分離
閱讀：338 發(fā)布時(shí)間：2023-4-24引言：在藥代動(dòng)力學(xué)(DMPK)研究中，體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的目的都是鑒定與藥物相關(guān)的組分 [2,3]。當(dāng)某些特殊代用配置亞 2 微米粒徑色譜柱的液相色譜儀改進(jìn)對(duì)生物樣品中代謝物的分離應(yīng)用謝物只用 LC-MS 鑒定還不夠，需要更多結(jié)構(gòu)信息時(shí)，用 LC 分離就成了關(guān)鍵步驟，要為核磁共振（NMR）分析等其它鑒定方法提供樣品。代謝物要從各種復(fù)雜基質(zhì)中分離，如血漿、尿液、糞便、肝臟和膽汁。在亞 2 微米小粒徑柱提供的快速和高分離度的推動(dòng)下，對(duì)常規(guī) HPLC 方法重新評(píng)價(jià)，是否能作為一種縮短代謝物分離時(shí)間的方法[4, 5]。
實(shí)驗(yàn)高分離度快速液相色譜用一些實(shí)驗(yàn)來(lái)確定，在高分離度快速液相色譜（RRLC）系統(tǒng)上用 1.8 微米色譜柱是否改善了色譜分離。所用的 RRLC 系統(tǒng)見(jiàn)圖 1。• 1200 系列 SL 型二元泵，配置微量真空脫氣機(jī)• 1200 系列高性能自動(dòng)進(jìn)樣器• 1200 系列柱溫箱• 1200 系列高速可變波長(zhǎng)檢測(cè)器• 1100 系列分析級(jí)餾分收集器色譜柱采用幾種不同柱長(zhǎng)和填料粒徑的 ZORBAX SBC18。為了保持恒定的樣品加載量和流速，內(nèi)徑固定在 4.6 mm。要獲得合適體積的餾分，流速設(shè)置約為1 mL/分鐘。所用色譜柱的詳細(xì)情況如下：
• 4.6 x 250 mm, 5 µm, 部件號(hào) 880975-906• 快速分離 4.6 x 150 mm, 3.5 µm，部件號(hào) 863953-902• 快速分離高通量 4.6 x 150 mm, 1.8 µm，部件號(hào)829975-902• 快速分離高通量 4.6 x 100 mm, 1.8 µm，部件號(hào)828975-902相關(guān)的方法參數(shù)包括：流動(dòng)相 A: 10 mM 醋酸銨，用醋酸調(diào)至 pH 5.0，流動(dòng)相 B: 75:25 乙腈: 甲醇?？勺儾ㄩL(zhǎng)檢測(cè)器(VWD)檢測(cè)波長(zhǎng) 235 nm，峰寬設(shè)置 > 0.005 分鐘，或 0.12-秒響應(yīng)時(shí)間，配置標(biāo)準(zhǔn)流通池(部件號(hào) G1314-60086)。
原方法(4.6 x 250 mm 柱)的梯度表如下：時(shí)間 %B0 2035 3550 5555 10055.1 到 60 20快速分離（RR）和快速分離高通量（RRHT）柱越短，時(shí)間將成比例地縮短。
樣品尿樣的分析結(jié)果見(jiàn)圖 2 和圖 3。尿液樣品的制備包括，取 10 倍量的尿液在室溫下真空離心干燥濃縮，然后用起始流動(dòng)相復(fù)溶。進(jìn)樣前，樣品再次離心，去除微粒。這種方法也可以用于血漿、肝臟勻漿和糞便勻漿。樣品制備包括，用三倍體積的溶劑（1:3，樣品：乙腈）旋渦混合分別提取三次，并離心。取出上清，混合，干燥。提取物用起始流動(dòng)相復(fù)溶，離心，然后進(jìn)樣。在大多數(shù)情況下，膽汁可以不經(jīng)過(guò)樣品制備直接進(jìn)樣。10 20 30 40 50 minmAU010020010 20 30 40 50 minmAU010020010 20 30 minmAU010020010 20 30 minmAU010020010 20 minmAU0100200M5 M13 M15M5 M13 M15 M17M5M13 M15M17M5M13 M15M17RR SB-C18 4.6 × 150 mm, 3.5 µmSB-C18 4.6 × 250 mm, 5 µmRRHT SB-C18 4.6 × 150 mm, 1.8 µmRRHT SB-C18 4.6 × 100 mm, 1.8 µm???: A: 10 mM ????????? pH 5.0 B: 75:25 (??ǖ??(?? :????????????: 1.0 mL/min???: 100 µL (?????????)?? :25 °C??: UV 232 nm??: ??????????????????M17圖 2. SB-C18 柱的可縮放性提高了 DMPK 代謝物分離方法的通量尿樣分析的結(jié)果見(jiàn)圖 1 和圖 3。鑒定出的感興趣藥物代謝物為色譜圖中的 M5、M13、M15 和 M17。
結(jié)果與討論在我們實(shí)驗(yàn)室里，因?yàn)榇郎y(cè)樣品的復(fù)雜性，用4.6 mm x 250 mm, 5 微米柱進(jìn)行色譜分析的時(shí)間，可能在 60 分鐘到 3 個(gè)小時(shí)。本研究的目標(biāo)就是要用現(xiàn)有的方法，在保持分離度和測(cè)試量的同時(shí)，縮短分析時(shí)間。
每次進(jìn)樣加載物質(zhì)的量部分地決定了所用的柱內(nèi)徑。通常，感興趣的代謝物以每毫升納克到微克水平存在于基質(zhì)中，大量?jī)?nèi)源性物質(zhì)占樣品中的絕大部分。為了從內(nèi)源性物質(zhì)中獲得最大量的代謝產(chǎn)物，經(jīng)常要使色譜柱超載。大量?jī)?nèi)源性物質(zhì)加載到色譜柱上，導(dǎo)致超載，影響色譜分離的完整性。要減少內(nèi)源性物質(zhì)與感興趣代謝物的共洗脫，必須采取少量多次進(jìn)樣。對(duì)這種長(zhǎng)達(dá) 1 小時(shí)的分析，多次進(jìn)樣只分離非常少量的物質(zhì)，顯得相當(dāng)浪費(fèi)時(shí)間。雖然我們實(shí)驗(yàn)室不要求高通量，但提高通量還是很重要。這里顯示的是用 Agilent 1200 系列高分離度快速液相色譜快速分離柱得到的結(jié)果。代謝研究中經(jīng)常要用 14C 同位素標(biāo)記化合物，將其作為一種有效方法，鑒定被內(nèi)源性化合物背景掩蓋下的藥物相關(guān)物質(zhì)。用亞 2 微米色譜柱進(jìn)行的這類研究將在以后的論文中發(fā)表。這里分析的是第一次從人體實(shí)驗(yàn)得到的樣品，藥物沒(méi)有標(biāo)記 14C 同位素標(biāo)記。為了分離制備，只監(jiān)測(cè)和報(bào)告了 UV 響應(yīng)。
在圖 2 中，顯示了對(duì)尿樣分析的比較，樣品中需要分離的代謝物水平非常低。原來(lái)在 ZORBAX SB-C184.6 mm x 250 mm, 5 µm 柱上建立的方法，分析時(shí)間為 60 分鐘。本樣品在用于比較的 4.6 mm x 100 mm,1.8 µm 柱和 4.6 mm x 150 mm, 1.8 µm 及 3.5 µm 柱上分離。梯度曲線按柱長(zhǎng)比例更改。正如所期望的，隨著粒徑和柱長(zhǎng)的減少，分離度和UV 響應(yīng)都有了增加。對(duì)每根色譜柱每種代謝物 UV響應(yīng)和峰寬的比較見(jiàn)表 1。每種代謝物的峰形都有明顯改善，可以看到理論塔板數(shù)的增加。請(qǐng)注意，如果用更小的 2.1 µm 內(nèi)徑柱，柱效還有可能進(jìn)一步改善。圖 2 還顯示了方法的耐用性和用 SB-C18 的可縮放性。不同的柱子配置，包括粒徑和長(zhǎng)度，對(duì)選擇性的影響很小。從四種分離都具有相同的洗脫曲線就可以看出這一點(diǎn)。由于為了每次分析純化出最大量的代謝物，有意識(shí)地讓色譜柱超載，所以感興趣的峰有拖尾現(xiàn)象。
結(jié)論結(jié)果表明 RRHT 技術(shù)提高了實(shí)驗(yàn)室的效率。用 RRHT柱取代常規(guī)色譜柱，在不影響分離度的情況下，提高了通量。最大的收獲是用更小粒徑(1.8 或 3.5 um)色譜柱，分離度的提高最大。用 RRHT 柱取代了常規(guī)尺寸色譜柱后，峰高和峰寬都有了改善。另外，分析時(shí)間與柱長(zhǎng)成比例地縮短。這些優(yōu)點(diǎn)將帶來(lái)實(shí)驗(yàn)室效率的提高。本方法在對(duì)復(fù)雜基質(zhì)進(jìn)行分析時(shí)（例如，尿和血漿）很容易在不同配置的 SB-C18 柱（包括不同的粒徑）之間放大和縮小，最大限度地簡(jiǎn)化了樣品制備。
