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          T4 DNA Polymerase (exo-)

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          更新時(shí)間:2024-01-12 15:29:23瀏覽次數(shù):753

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          產(chǎn)品簡(jiǎn)介

          供貨周期 現(xiàn)貨 規(guī)格 250U
          貨號(hào) A-PJ1057 應(yīng)用領(lǐng)域 化工
          主要用途 僅供科研研究實(shí)驗(yàn)    
          T4 DNA Polymerase (exo-)公司正在出售的產(chǎn)品:人角膜上皮細(xì)胞 鉀離子通道亞家族T成員1封閉多肽 克柔念珠菌PCR檢測(cè)試劑盒 大鼠熱休克蛋白27(HSP-27)試劑盒 ELISA 磷脂A2(PLA2)活性比色法檢測(cè)試劑盒 運(yùn)動(dòng)魯杰氏菌 胸腺抗體

          詳細(xì)介紹

          商品屬性:

          產(chǎn)品名稱

          規(guī)格

          貨號(hào)

          T4 DNA Polymerase (exo-)

          250U

          A-PJ1057

          該酶是來(lái)源于 T4 噬菌體的 DNA 聚合酶,又名 T4gp43,在 T4 噬菌體 DNA 復(fù)制過(guò)程中引導(dǎo)先導(dǎo)鏈和滯后鏈沿 5‘-3’方向延伸。 通過(guò)點(diǎn)突變修飾 D219A,使得該酶失去 3’-5’ 外切核酸酶的活性,而保留了聚合酶活性,且該酶的聚合酶活性強(qiáng)于 DNA 聚合酶 I。 與 DNA聚合酶 I 不同,T4 DNA 聚合酶不具有 5’ -3’ 核酸外切酶活性。
          QQ截圖20240110094643.jpgimage.png

          活性單位定義:
          一個(gè)活力單位即在 37°C 條件下,30 分鐘內(nèi)催化 10 nmoldNTP 的摻入反應(yīng)成為酸不溶性物質(zhì)所需的酶量。
          儲(chǔ)存:-20℃可保存 3 年。
          10X T4 DNA Pol Buffer
          200 mM Tris-HCl,pH7.9
          500 mM NaCl
          100 mM MgCl2
          5 mM DTT
          1mg/ml BSA
          熱失活: 75°C, 20 min
          Storage Buffer:
          20mM Tris-HCl,pH7.5
          200mM NaCl
          5mM DTT
          50% Glycero



          65.jpg

          67.jpg


          PCR基本步驟及注意事項(xiàng)?

          一、實(shí)驗(yàn)原理

          PCR是體外人工選擇性擴(kuò)增DNA的一種方法,它類似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而體外PCR反應(yīng)同樣需要類似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設(shè)計(jì)的特定序列,實(shí)現(xiàn)對(duì)特定位置的擴(kuò)增;PCR Buffer提供一個(gè)反應(yīng)的緩沖環(huán)境;反應(yīng)過(guò)程同生物體內(nèi)一樣,DNA雙鏈打開(kāi),引物結(jié)合模板,延伸形成新鏈。而這些過(guò)程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈,而在體外在通過(guò)控制反應(yīng)溫度實(shí)現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開(kāi)雙鏈,在退火溫度處引物結(jié)合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反復(fù)重復(fù)此過(guò)程即可實(shí)現(xiàn)對(duì)特定片段DNA的大量擴(kuò)增。到第三循環(huán)開(kāi)始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子,進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

          在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來(lái)呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺(tái)效應(yīng)。平臺(tái)期(Plateau)會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增,達(dá)到較高水平。因此,應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù),在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng), 減少非特異性產(chǎn)物。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

          二、主要的成分

          1.模板可以是多種形式,主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物,cDNA等,但不能為RNA。對(duì)于不同類型的模板,其主要不同在于預(yù)變性的時(shí)間以及模板的量。一般對(duì)于大的基因組DNA預(yù)變性時(shí)間10min足夠,質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可。

          注意cDNA為單鏈DNA,但仍可做PCR的模板,只不過(guò)在第一輪循環(huán)時(shí)只有一個(gè)引物結(jié)合,合成另一條鏈。從第二輪開(kāi)始,兩個(gè)引物均與特異位點(diǎn)結(jié)合,從而實(shí)現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增,原因就在于實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶,只能特意識(shí)別DNA鏈。

          2.對(duì)于模版的量來(lái)說(shuō),一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對(duì)于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜,提取的濃度也往往比較大,為防止?jié)舛冗^(guò)大對(duì)PCR造成影響,故需對(duì)提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過(guò)高則可能會(huì)引起非特異性擴(kuò)增。對(duì)于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,且提取濃度一般較低,則無(wú)需稀釋。

          PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意的問(wèn)題有哪些?

          沒(méi)有ct值

          檢測(cè)結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問(wèn)題:

          1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過(guò)45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));

          2、PCR程序設(shè)置錯(cuò)誤,檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸時(shí)采集信號(hào),另外熒光采集是否選中;

          3、引物或探針降解??赏ㄟ^(guò)PAGE電泳檢測(cè)引物和探針是否降解;

          4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過(guò)500ng,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)即可), 對(duì)未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲(chǔ)備,避免反復(fù)凍融;

          5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴(kuò)增基因組DNA;上下游引物Tm值超過(guò)4℃以上也會(huì)影響擴(kuò)增)。

          ct值過(guò)晚

          在相對(duì)定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對(duì)定量中, 對(duì)低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會(huì)增大, 但是一般不宜超過(guò)40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確。

          因此,判斷Ct值出現(xiàn)過(guò)晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行。

          1、擴(kuò)增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計(jì)不合理, 需要重新設(shè)計(jì);

          2、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時(shí)間短(可以在推薦的時(shí)間條件下延長(zhǎng)10s);

          3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;

          4、PCR產(chǎn)物太長(zhǎng)。PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過(guò)500bp;

          5、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測(cè)或?qū)⒛0暹M(jìn)行稀釋。

          公司正在出售的產(chǎn)品:

          禽白血病病毒C亞群染料法熒光定量RT-PCR試劑盒,停

          鼻病毒ELISA試劑盒 IgA免費(fèi)代測(cè)試劑

          尤氏泰勒蟲(chóng)染料法熒光定量PCR試劑盒

          嗜人錐蠅PCR檢測(cè)試劑盒價(jià)格

          單純皰疹病毒型抗體ELISA試劑盒 HSVⅠAb免費(fèi)代測(cè)試劑

          蟾分枝桿菌PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

          豬藍(lán)耳病毒(歐洲株)核檢測(cè)試劑盒

          細(xì)胞周期E2ELISA試劑盒

          馬梭菌探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒

          漢坦病毒PCR檢測(cè)試劑盒

          膽綠還原BELISA試劑盒

          馬隱秘桿菌探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒

          馬皰疹病毒2型染料法熒光定量PCR試劑盒

          低分子質(zhì)量蛋白7/β型蛋白體9ELISA試劑盒

          肉毒梭狀桿菌探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒

          秦皮探針?lè)?/span>PCR鑒定試劑盒

          凋亡抑制因子3ELISA試劑盒

          牛副結(jié)核分歧桿菌(MPB)核檢測(cè)試劑盒

          禽白血病病毒通用PCR檢測(cè)試劑盒

          -3ELISA試劑盒

          鉛黃腸球菌探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒

          馬皰疹病毒1型探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒

          多肽-N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移6ELISA試劑盒

          鏈狀帶絳蟲(chóng)PCR檢測(cè)試劑盒供應(yīng)

          馬流產(chǎn)沙門(mén)氏菌PCR檢測(cè)試劑盒

          二氫嘧啶ELISA試劑盒

          牛瘟病毒PCR檢測(cè)試劑盒價(jià)格

          侵肺巴斯德菌PCR檢測(cè)試劑盒

          防御α3ELISA試劑盒

          馬生殖泰勒氏菌PCR檢測(cè)試劑盒

          利什曼原蟲(chóng)通用染料法熒光定量PCR試劑盒

          人端粒重復(fù)序列結(jié)合因子2(TERF2)ELISA試劑盒

          普通變形桿菌PCR檢測(cè)試劑盒

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          CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白δ(C/EBPδ)檢測(cè)試劑盒elisa

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          人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子13(FGF-13)試劑盒ELISA

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          α乳清蛋白(α-La)ELISA試劑盒

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          前病毒探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒

           


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