Equi-phi29 DNA Polymerase公司正在出售的產(chǎn)品：人腦髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞　線粒體脫偶連蛋白2封閉多肽　卡奇谷病毒PCR檢測(cè)試劑盒　大鼠去甲(NA)ELISA試劑盒　磷丙糖異構(gòu)（TPI）活性比色法檢測(cè)試劑盒　濟(jì)州島古名菌　2號(hào)染色體開(kāi)放閱讀框68抗體

商品屬性：

是 phi29 的改造體，并經(jīng)多次純化分離而得。在保留了 phi29 DNA 聚合酶的鏈置換、連續(xù)合成特性（>70kb）的基礎(chǔ)上，提高了滾環(huán)擴(kuò)增的反應(yīng)溫度，該酶酶可以在 42 度條件下持續(xù)的進(jìn)行 DNA 合成（而 phi29 DNA 聚合酶在此溫度下反應(yīng)活性很低）。

這種高溫的反應(yīng)特性，在以下幾個(gè)方面對(duì)實(shí)驗(yàn)有明顯的提升：

（1）在 NGS 測(cè)序中，其提升了高 GC 含量、回文結(jié)構(gòu)等復(fù)雜模板的延伸能力，使得 NGS 的覆蓋度更均一，降低測(cè)序所需深度；

（2）高溫的反應(yīng)條件，提升了基因組 DNA的 WGA 產(chǎn)物的合成量，并可以進(jìn)行變溫?cái)U(kuò)增；

（3）降低測(cè)序中 Gap 區(qū)域，提升單細(xì)胞測(cè)序的數(shù)據(jù)質(zhì)量和完整度；

（4）降低非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；

（5）提升 MDA/RCA 等實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增性能和特異性。
除此外，該酶仍然具有很強(qiáng)的 3’→5’外切酶校讀功能，合成的 DNA 片段保真性高。該酶的外切酶活性較強(qiáng)，因此合成過(guò)程中引物需要 3’端硫代修飾，以降低外切活性對(duì)引物的切割效應(yīng)。

儲(chǔ)存：-20℃可保存 3 年。
注意：在不同的實(shí)驗(yàn)類(lèi)型中，Oligo根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要自行選擇。
2. 引物和模板退火：體系配制完畢后，放置到 PCR 儀中，95℃ 3min，25℃ 3min。3. 退火完畢后，向退火產(chǎn)物中加入 1μl Equi-phi29 DNAPolymerase，混合均勻。
4. 擴(kuò)增反應(yīng)
4.1 恒溫?cái)U(kuò)增
對(duì)于環(huán)狀DNA模板采用恒溫反應(yīng)作為推薦使用30℃恒溫?cái)U(kuò)增，30℃孵育 6~16h.該酶在 30-42℃條件下均可工作，
必要時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)類(lèi)型進(jìn)行調(diào)整。
4.2 變溫?cái)U(kuò)增
對(duì)于基因組 DNA 或 cDNA 模板，推薦使用變溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，以在短時(shí)間內(nèi)獲得更高產(chǎn)量，并提高了低濃度模板的擴(kuò)增產(chǎn)量。在 PCR 儀上做如下設(shè)置：
【30℃ 5min；42℃ 15s】循環(huán) 72 次（約 6h）或 120次（約 10h）.必要時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，可于 65°C 10min 進(jìn)行失活反應(yīng)。
使用注意事項(xiàng)
（1）必要時(shí)可單獨(dú)額外添加終濃度 1 mM DTT 和 0.2mg/ml BSA，可提高反應(yīng)效率。
（2）該酶的最佳反應(yīng)溫度為 42 ℃ （在 30~42℃之間均有活性）。
（3）65℃ 10min 即可使該酶失活。
（4）根據(jù)實(shí)驗(yàn)類(lèi)型需要，調(diào)整dNTP的濃度100~500 μM。
（5）添加 Yeast Pyrophosphatase可提高 DNA 產(chǎn)量。
（6）反應(yīng)引物 3’端的硫代修飾可避免引物降解。

PCR基本步驟及注意事項(xiàng)？

一、實(shí)驗(yàn)原理

PCR是體外人工選擇性擴(kuò)增DNA的一種方法，它類(lèi)似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應(yīng)同樣需要類(lèi)似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設(shè)計(jì)的特定序列，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定位置的擴(kuò)增；PCR Buffer提供一個(gè)反應(yīng)的緩沖環(huán)境；反應(yīng)過(guò)程同生物體內(nèi)一樣，DNA雙鏈打開(kāi)，引物結(jié)合模板，延伸形成新鏈。而這些過(guò)程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過(guò)控制反應(yīng)溫度實(shí)現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開(kāi)雙鏈，在退火溫度處引物結(jié)合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復(fù)重復(fù)此過(guò)程即可實(shí)現(xiàn)對(duì)特定片段DNA的大量擴(kuò)增。到第三循環(huán)開(kāi)始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來(lái)呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱(chēng)為平臺(tái)效應(yīng)。平臺(tái)期(Plateau)會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，達(dá)到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng)， 減少非特異性產(chǎn)物。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物，cDNA等，但不能為RNA。對(duì)于不同類(lèi)型的模板，其主要不同在于預(yù)變性的時(shí)間以及模板的量。一般對(duì)于大的基因組DNA預(yù)變性時(shí)間10min足夠，質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過(guò)在第一輪循環(huán)時(shí)只有一個(gè)引物結(jié)合，合成另一條鏈。從第二輪開(kāi)始，兩個(gè)引物均與特異位點(diǎn)結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增，原因就在于實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶，只能特意識(shí)別DNA鏈。

2.對(duì)于模版的量來(lái)說(shuō)，一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對(duì)于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^(guò)大對(duì)PCR造成影響，故需對(duì)提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過(guò)高則可能會(huì)引起非特異性擴(kuò)增。對(duì)于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，且提取濃度一般較低，則無(wú)需稀釋。

PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意的問(wèn)題有哪些?

沒(méi)有ct值

檢測(cè)結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問(wèn)題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過(guò)45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));

2、PCR程序設(shè)置錯(cuò)誤,檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸時(shí)采集信號(hào),另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解?？赏ㄟ^(guò)PAGE電泳檢測(cè)引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過(guò)500ng,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)即可), 對(duì)未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲(chǔ)備,避免反復(fù)凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴(kuò)增基因組DNA;上下游引物Tm值超過(guò)4℃以上也會(huì)影響擴(kuò)增)。

ct值過(guò)晚

在相對(duì)定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對(duì)定量中, 對(duì)低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會(huì)增大, 但是一般不宜超過(guò)40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過(guò)晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行。

1、擴(kuò)增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計(jì)不合理, 需要重新設(shè)計(jì);

2、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時(shí)間短(可以在推薦的時(shí)間條件下延長(zhǎng)10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產(chǎn)物太長(zhǎng)。PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過(guò)500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測(cè)或?qū)⒛０暹M(jìn)行稀釋。

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